pH響應(yīng)性可降解聚(醚酯-氨酯)的制備及在藥物緩釋領(lǐng)域的應(yīng)用

pH響應(yīng)性可降解聚(醚酯-氨酯)的制備及在藥物緩釋領(lǐng)域的應(yīng)用

張冬梅,張娜，紀(jì)晨旭,趙海云,張丹丹,劉文坤（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東省仿制藥一致性評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南250101；2.山東羽時(shí)生物科技有限公司，山東濟(jì)南250014；3.濟(jì)南康橋醫(yī)藥科技有限公司，山東濟(jì)南250100）隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，關(guān)于生物醫(yī)療高分子材料的研究受到研究人員的廣泛關(guān)注[1]。理想的生物醫(yī)用材料應(yīng)當(dāng)具備良好的生物相容性、降解無(wú)毒以及易加工成型等性能。這其中，生物可降解聚氨酯在組織支架、外科手術(shù)、藥物釋放載體等生物醫(yī)療領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)[2-5]。此外，聚氨酯的力學(xué)性能優(yōu)異且易于改性，在其分子結(jié)構(gòu)中引入特殊的功能基團(tuán)可賦予其額外的物理化學(xué)性質(zhì)[6,7]。作為藥物載體，傳統(tǒng)的醫(yī)用材料多為將藥物包裹于材料內(nèi)部，由于藥物與材料之間的作用力有限，這類載藥體系往往缺乏靶向作用，在正常生理環(huán)境中易出現(xiàn)治療藥物不可控?cái)U(kuò)散，導(dǎo)致漏釋或早釋現(xiàn)象，從而引發(fā)中毒等不良后果[8]。為了解決這一問(wèn)題，環(huán)境響應(yīng)型醫(yī)用材料逐漸受到人們的重視。常見(jiàn)的環(huán)境響應(yīng)材料主要包括有因pH[9]、溫度[10]、磁場(chǎng)[11]和光照[12]等條件的變化而引起自身物理化學(xué)性質(zhì)變化的材料。因此，可通過(guò)將特定響應(yīng)基團(tuán)引入到醫(yī)療材料的分子結(jié)構(gòu)中來(lái)制備環(huán)境響應(yīng)型生物醫(yī)用材料。眾所周知，人體各組織部位的生理pH值存在顯著差異，特別是腫瘤細(xì)胞（pH=4～6）要明顯低于正常細(xì)胞（pH=7.4），因此，可通過(guò)pH響應(yīng)材料負(fù)載治療藥物以實(shí)現(xiàn)對(duì)病變部位的靶向釋放[13-15]，因此pH響應(yīng)材料的設(shè)計(jì)和制備就成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文設(shè)計(jì)和制備了一種具有pH響應(yīng)的可降解聚氨酯材料。首先合成了含吡啶的二醇化合物(PyDH)，然后通過(guò)簡(jiǎn)單的縮聚方法將其引入到聚氨酯中，制備了側(cè)鏈含吡啶基團(tuán)的聚(醚酯-氨酯)（PEEU-Py）。對(duì)PyDH和PEEU-Py的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性能進(jìn)行了表征和研究。針對(duì)其在靶向給藥方面的潛在應(yīng)用，詳細(xì)研究了PEEU-Py膜材料的pH敏感溶脹性能和藥物釋放行為與介質(zhì)pH值的關(guān)系。并且對(duì)材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行了測(cè)試，進(jìn)一步對(duì)材料作為藥物緩釋材料做出生物學(xué)評(píng)價(jià)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1原料與試劑聚乙二醇(PEG，Mn=2000)、ε-己內(nèi)酯(ε-CL，99%):Sigma-Aldrich試劑，使用前均80℃真空除水2h；二月桂酸二丁基錫(DBTDL，95%)、二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI，98%)、4-乙烯基吡啶(VP，96%)、3-巰基-1,2丙二醇(TG，97%):阿拉丁試劑有限公司；N,N-二異丙基乙胺(DIPA，99%):百靈威科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：分析純，天津科密歐試劑有限公司，使用前加CaH2回流后重蒸。1.2PEEU-Py膜的制備1.2.1PyDH的制備：通過(guò)巰基與烯烴的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備了PyDH，如Fig.1(a)所示，將VP(5.26g,0.05mol)和TG(5.41g,0.05mol)溶于10mLDMF，加入反應(yīng)瓶中攪拌均勻，再加入DIPA(0.13g，1.0mmol)，干燥氬氣保護(hù)下室溫反應(yīng)5h。經(jīng)大量冰乙醚沉降，重復(fù)3次后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醚，得淡黃色黏稠液體，產(chǎn)率為94.2%。1.2.2聚酯醚PECL的制備：如Fig.1(b)所示，取除水后的PEG(20g,0.010mol)和ε-CL(20g,0.175mol)于三口瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的DBTDL催化劑，在氬氣保護(hù)下，升溫至140℃反應(yīng)20h。反應(yīng)后將產(chǎn)物溶于少量氯仿，經(jīng)6～8倍冰乙醚沉降、抽濾，此過(guò)程重復(fù)3次，常溫真空干燥至恒量得到PECL，產(chǎn)率為92.6%。GPC(THF)：Mn=3940,MWD=1.12。1.2.3聚氨酯PEEU-Py的制備：反應(yīng)方程式如Fig.1(c)所示，投料比例按照Tab.1進(jìn)行。將一定量的PECL和PyDH溶于5mLDMF溶液后加入到裝有機(jī)械攪拌裝置的三口瓶中，再加入MDI的DMF溶液(0.25g/mL)和0.03g催化劑DBTDL，攪拌均勻后，在氬氣保護(hù)下，80℃油浴反應(yīng)，至紅外檢測(cè)—NCO吸收峰(2250～2280cm-1)完全消失。反應(yīng)過(guò)程中若體系變黏，加少量DMF稀釋，約3h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF稀釋至0.25g/mL，經(jīng)8倍冰乙醚沉降，抽濾，常溫下真空干燥至恒量得到聚氨酯PEEU-Py。根據(jù)PECL與PyDH的摩爾比將產(chǎn)物分別命名為PEEUPy-1/2，PEEU-Py-1/4，PEEU-Py-1/6和PEEU-Py-1/8。1.2.4PEEU-Py膜材料的制備：將PEEU-Py用氯仿溶解，得到質(zhì)量濃度為4.0g/mL的溶液，減壓除去溶液中的氣體，離心后將上清液緩慢注入聚四氟乙烯磨具中，常溫自然揮發(fā)4d后轉(zhuǎn)移至40℃真空干燥箱繼續(xù)干燥3d，得到透明狀的淡黃色膜材料，厚度為(0.35±0.02)mm。Fig.1Syntheticpathwayof(a)PyDH,(b)PECLand(c)PEEU-PyTab.1CompositionsandmolecularweightofthePEEU-Pysamples1.3測(cè)試與表征1.3.1化學(xué)結(jié)構(gòu)表征：1H-NMR采用德國(guó)Bruker公司的AVANCEII型核磁共振波譜儀(400MHz)，以氘代氯仿為溶劑；IR采用德國(guó)Bruker公司的Alpha型傅里葉變換紅外光譜儀，掃描范圍400～4000cm-1，分辨率為4cm-1；滲透凝膠色譜(GPC)使用美國(guó)Waters公司的2414型凝膠滲透色譜儀，流動(dòng)相為四氫呋喃，流速1.0mL/min，校準(zhǔn)物質(zhì)為單分散聚苯乙烯。1.3.2熱性能分析：膜的熱穩(wěn)定性使用美國(guó)Universal公司的2050型熱重分析儀(TGA)測(cè)定，氮?dú)獗Ｗo(hù)下以20℃/min的升溫速率從室溫加熱到600℃；熱轉(zhuǎn)變使用美國(guó)TA公司的2910型差示掃描量熱儀(DSC)，以液氮為冷卻劑，以10℃/min的升溫速率從-40℃加熱到180℃對(duì)材料的熔融行為進(jìn)行測(cè)試。1.3.3結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析：通過(guò)德國(guó)布魯克公司D8AVANCE型X射線粉末衍射儀（XRD）表征材料的結(jié)晶性。將膜材料裁剪為1cm×1cm正方形置于樣品臺(tái)，設(shè)定電壓和電流分別為40kV和20mA，以15(°)/min的速度在2θ為5°～55°范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。1.3.4親水性和溶脹率測(cè)試：材料表面的親水性通過(guò)其表面與水形成的接觸角進(jìn)行測(cè)定，將膜材料裁剪為1cm×1cm大小，使用芬蘭KSV公司的CAM200型水接觸角測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。溶脹率采用平衡吸水率的方法測(cè)定，將完全干燥的膜材料（1cm×1cm，質(zhì)量記為mo）浸入PBS溶液中(pH=1.5，7.0，11.5)，每隔一段時(shí)間用濾紙擦除表面水漬后稱量，直至質(zhì)量不再增加，即達(dá)到平衡溶脹，質(zhì)量記為mp，每個(gè)樣品平行測(cè)量3次。平衡吸水率（WU）通過(guò)式(1)計(jì)算:1.3.5力學(xué)性能測(cè)試：根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO527-2-2012，將材料裁剪為標(biāo)準(zhǔn)啞鈴狀，在單柱拉力機(jī)(HY939C型，恒宇)上進(jìn)行拉伸測(cè)試，拉伸速率為50mm/min。1.3.6體外模擬降解分析：通過(guò)質(zhì)量損失法測(cè)定膜材料的水解降解性。將干燥的1cm×1cm大小的膜材料稱量后記為m0，浸入模擬體液(SBF)，密封后置于(37±0.5)℃的生物培養(yǎng)箱中，每隔一段時(shí)間后將膜材料取出，干燥后稱質(zhì)量為mn(n=1,2,3,…)，直至膜材料完全破碎無(wú)法稱量。每個(gè)樣品平行3次。通過(guò)式(2)計(jì)算降解失重率（W）1.3.7藥物緩釋分析：將4.0g膜材料和40mg頭孢西酮溶于150mLDMF中,通過(guò)溶劑揮發(fā)法制備載藥膜材料。取3份一定質(zhì)量的膜材料，分別浸入PBS溶液(pH=1.5，7.0，11.5)中，密封置入(37±0.5)℃的生物培養(yǎng)箱中，每隔2h后取1mL的PBS溶液，稀釋至一定濃度后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定204nm的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物釋放量。頭孢西酮在不同pH值的PBS溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：1.3.8細(xì)胞毒性分析：以小鼠L929成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，通過(guò)MTT法[16,17]測(cè)定膜浸出液的細(xì)胞毒性。先用乙醇清洗材料表面，紫外滅菌20min后用3mLDMEM(添加10%牛胎血清)中提取浸出液，將浸出液按體積比1:1稀釋后取0.1mL加入培養(yǎng)板中，以5×104mL-1的密度接種L929細(xì)胞。空白對(duì)照為新鮮培養(yǎng)液中的L929細(xì)胞。將細(xì)胞在37℃，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)72h，用0.5mg/mL噻唑藍(lán)(MTT)測(cè)定細(xì)胞毒性。使用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光度，與對(duì)照組參照，計(jì)算細(xì)胞存活率。Fig.21H-NMRspectrafor(a)MDI,(b)PyDH,(c)PECLand(d)PEEU-Py-1/82結(jié)果與討論2.1核磁共振分析MDI，PyDH，PECL和PEEU-Py-1/8的1H-NMR見(jiàn)Fig.2(PEEU-Py-1/2～1/8的譜圖基本一樣，這里以PEEU-Py-1/8為例)。在PyDH的1H-NMR譜圖(Fig.2b)中，δ7.28～8.48，δ4.64～4.82，δ3.61和δ2.53～3.36分別為吡啶環(huán)、羥基、次甲基和亞甲基上的質(zhì)子峰，并且沒(méi)有出現(xiàn)烯鍵(δ6.75)和巰基(δ2.07)的質(zhì)子峰，說(shuō)明雙鍵與巰基完全反應(yīng)。在PECL的1H-NMR譜圖(Fig.2c)中，δ4.06，δ2.29和δ3.64處的峰可歸于PCL和PEG鏈段中的亞甲基質(zhì)子峰。根據(jù)峰面積之比，說(shuō)明開(kāi)環(huán)反應(yīng)完全，不存在殘留的單體ε-CL。而在PEEU-Py-1/8的1H-NMR譜圖(Fig.2d)中，羥基峰消失，說(shuō)明羥基與—NCO完全反應(yīng)，同時(shí)還保留了苯環(huán)、吡啶環(huán)和PECL中亞甲基的質(zhì)子峰。從以上分析可以確定PEEU-Py的成功合成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)符合預(yù)期。Fig.3IRspectraof(a)MDI,(b)PyDH,(c)PECLand(d)PEEUPy-1/82.2紅外光譜分析Fig.3為MDI，PyDH，PECL和PEEU-Py-1/8的IR譜圖（PEEU-Py-1/2～1/8的譜圖基本一樣，這里以PEEU-Py-1/8為例）。在PyDH的IR譜圖(Fig.3b)中，1618cm-1和1422cm-1處的吸收峰分別為吡啶環(huán)中的C=N和C=C的吸收峰，說(shuō)明PyDH含有吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)S—H的吸收峰，說(shuō)明不存在未反應(yīng)的巰基。在PECL的IR譜圖(Fig.3c)中，1092cm-1，1723cm-1和3510cm-1處的吸收峰分別為醚鍵C—O—C、酯基中的C=O和末端羥基的—OH的吸收峰，不存在環(huán)酯基中的C=O吸收峰(1760cm-1)，說(shuō)明ε-CL發(fā)生了開(kāi)環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)物中無(wú)單體殘留。將PEEU-Py-1/8(Fig.3d)與MDI(Fig.3a)的IR譜圖相比，—NCO的吸收峰(2270cm-1)完全消失，新生成了氨基甲酸酯的吸收峰(3325cm-1和1732cm-1)，同時(shí)還保留了PyDH和PECL各部分結(jié)構(gòu)的吸收峰，進(jìn)一步確定聚氨酯的合成。2.3熱轉(zhuǎn)變分析PEEU-Py膜的DSC曲線及相應(yīng)的特征值分別見(jiàn)Fig.4和Tab.2。從曲線中可以發(fā)現(xiàn)，所有膜材料只出現(xiàn)1個(gè)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)，說(shuō)明軟硬段的微相分離程度較低。這一方面是由于氨基甲酸酯中的—NH—與C=O之間形成了分子間氫鍵，限制了分子鏈段的運(yùn)動(dòng)能力；另一方面，柔性的PEG鏈段起到增塑的作用，降低了軟硬段之間的極性差異。另外，還可以發(fā)現(xiàn)所有DSC曲線存在1個(gè)較寬的熔融吸熱峰(Tm)，這表明PEEU-Py具有一定的結(jié)晶性，但吸熱峰的焓變較小，說(shuō)明結(jié)晶性較低。從Tab.2中可以發(fā)現(xiàn)，隨著PyDH含量的增加，PEEU-Py的Tg從28.7℃逐漸增加至28.3℃、Tm從85℃增加至104℃，然而各吸熱峰的焓變值（ΔHf）卻從12.6J/g降低至3.4J/g。這歸因于PyDH中含有剛性的吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)，PyDH含量增加，形成的氫鍵也越多，限制了鏈的運(yùn)動(dòng)，從而降低了材料的微相分離結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致低的結(jié)晶能力。Fig.4DSCcurvesofPEEU-Pyfilms2.4結(jié)晶性分析Fig.5為PEEU-Py膜材料的XRD曲線。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，所有膜材料在2θ=21.5°均出現(xiàn)1個(gè)寬而散的衍射峰，表現(xiàn)出典型的低結(jié)晶聚合物的特征。隨著PyDH含量的增加(PEEU-Py-1/2～1/8)，衍射峰的強(qiáng)度逐漸降低，應(yīng)為硬段含量的增加導(dǎo)致了分子鏈之間的氫鍵增加，限制了分子鏈的有序排列。XRD結(jié)果與DSC曲線分析相一致。Tab.2ThermaltransformationpropertiesofPEEU-PyfilmsFig.5XRDpatternsofPEEU-Pyfilms2.5表面親水性和溶脹率通過(guò)測(cè)定膜表面水接觸角來(lái)評(píng)價(jià)PEEU-Py表面的親水性，結(jié)果如Fig.6所示。從圖中可以看出，PEEU-Py膜材料表面呈現(xiàn)一定的親水性，但親水性較低。隨著PyDH含量的增加(PEEU-Py-1/2～1/8)，水接觸角從72.3°逐漸降低至57.8°,膜表面親水性逐漸增強(qiáng)。這是因?yàn)椴牧媳砻娴挠H水性與其表面的親水組分相關(guān)，在PEEU-Py中含有2種親水組分，分別是PEG鏈段和吡啶基團(tuán)。隨著PyDH的增加，PEG含量相對(duì)降低，但吡啶環(huán)的增幅要大于PEG鏈段的降幅，同時(shí)，吡啶基團(tuán)位于側(cè)鏈，其N原子更容易與水形成氫鍵，形成富集在材料表面的親水層，所以整體表現(xiàn)為親水性逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。Fig.6SurfacewatercontactangleofPEEU-Pyfilms材料溶脹性通過(guò)其平衡吸水率來(lái)測(cè)定，F(xiàn)ig.7為PEEU-Py膜材料在不同pH值介質(zhì)中(pH=1.5，pH=7.4和pH=11.5)的平衡吸水率。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，所有PEEU-Py膜材料在3種pH環(huán)境下都表現(xiàn)出相似的溶脹行為,其平衡吸水率為：酸性介質(zhì)＞中性介質(zhì)＞＞堿性介質(zhì)。在pH=1.5的介質(zhì)中，膜的平衡吸水率分別為pH=7.0和pH=11.5的2倍和8倍以上。隨著PyDH質(zhì)量分?jǐn)?shù)從8.24%增加到21.19%(Tab.1)，平衡吸水率在酸性介質(zhì)中逐漸增大，而在中性介質(zhì)基本不變，堿性介質(zhì)中反而略微下降。這與吡啶基團(tuán)的pKb=8.75相一致，該溶脹行為表明PEEU-Py膜隨著外界酸堿條件的改變表現(xiàn)出優(yōu)異的pH敏感性。這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，吡啶環(huán)上的N原子容易與H+質(zhì)子化形成NH+，不僅親水性更強(qiáng)，而且破壞了吡啶環(huán)與氨基甲酸酯基團(tuán)之間的氫鍵，同時(shí)帶電基團(tuán)之間靜電斥力也導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)空間的增大，更易水分子進(jìn)入材料內(nèi)部；在堿性(或中性)條件下，吡啶環(huán)與氨基甲酸酯之間還可以形成額外的氫鍵，從而使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密可進(jìn)一步阻礙水分子的進(jìn)入，導(dǎo)致低的平衡吸水率。PEEU-Py靈敏的pH敏感性，還因?yàn)槲挥趥?cè)鏈的吡啶基團(tuán)具有更高的自由度，更易與介質(zhì)中的H+發(fā)生作用。總的來(lái)說(shuō)，PEEU-Py有優(yōu)異的pH響應(yīng)性，有望用作智能控制藥物釋放載體的可逆開(kāi)關(guān)。Fig.7EquilibriumwaterabsorptionofPEEU-PyfilmsFig.8Stress-straincurvesofPEEU-Pyfilms2.6力學(xué)性能材料的力學(xué)性能與其組成及分子鏈排布密切相關(guān)，這對(duì)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的生物材料具有重要的意義。Fig.8為PEEU-Py膜在室溫下的應(yīng)力-應(yīng)變曲線，從曲線中得到的特征值見(jiàn)Tab.3。所有PEEU-Py樣品都呈現(xiàn)出一個(gè)平滑的屈服點(diǎn)，這表示材料從彈性到塑性的轉(zhuǎn)變。隨著PyDH含量的增加(PEEUPy-1/2～-1/8)，斷裂強(qiáng)度和彈性模量逐漸增加，分別從1.8MPa和0.9MPa增加至12.1MPa和9.6MPa；斷裂伸長(zhǎng)率依次降低，從1667%降低至502%。這主要?dú)w因于硬段含量的增加，與文獻(xiàn)報(bào)道的規(guī)律一致[18]?？傮w而言，PEEU-Py膜具有優(yōu)異的拉伸性能，可以滿足其作為醫(yī)療衛(wèi)生材料對(duì)力學(xué)性能的要求。2.7體外模擬降解生物可降解是作為藥物載體高分子材料的必要前提，通過(guò)檢測(cè)材料在SBF中的質(zhì)量損失來(lái)研究PEEU-Py的降解性，失重曲線如Fig.9所示?？梢钥闯?，PEEU-Py-1/2降解速率最快，在第9周后已完全破碎無(wú)法稱量，失重率達(dá)到50.4%。隨著PyDH含量的增加(PEEU-Py-1/2～1/8)，其降解失重率依次降低。PEEU-Py的降解主要是酯鍵的水解降解，所以降解速率主要受酯鍵含量和與水接觸程度的影響。隨著PyDH含量的增加，一方面材料中酯鍵的相對(duì)含量逐漸降低；另一方面，硬段含量的增加會(huì)使分子鏈間形成更多的氫鍵，從而導(dǎo)致更緊密的三維結(jié)構(gòu)，抑制了水與酯鍵的接觸，降解速率降低。Fig.9MasslosscurvesofPEEU-PyfilmsagainstdegradationtimeinPBS(pH=7.4)2.8藥物緩釋Fig.10和Fig.11分別為PEEU-Py-1/8膜材料的藥物釋放曲線(其他膜材料藥物釋放趨勢(shì)與之相同)和不同PyDH含量的PEEU-Py膜在不同pH值介質(zhì)下的最大藥物釋放量。從Fig.10可以發(fā)現(xiàn)，PEEU-Py-1/8膜材料在不同pH值的藥物釋放速率和藥物釋放量存在明顯差異：在pH=1.5環(huán)境下藥物釋放速率最快，在24h后藥物釋放量能夠達(dá)到81.5%；在pH=11.5環(huán)境下藥物釋放速率最慢，24h后的藥物釋放量不足15%。這說(shuō)明以PEEU-Py-1/8材料為載體的藥物釋放具有靈敏的pH響應(yīng)性，pH值越低，藥物釋放量越高，藥物釋放速率越快。此外，在pH=1.5和pH=7.0環(huán)境下，最大藥物釋放量隨著PyDH含量的增加而增加(Fig.11)，而在pH=11.5環(huán)境下恰恰相反。這一趨勢(shì)與前面的溶脹率(或吸水率)結(jié)果相一致：高溶