基礎(chǔ)生物工程大實(shí)驗(yàn)(第一部分1)

基礎(chǔ)生物工程大實(shí)驗(yàn)閻欲曉粟桂嬌廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

2011.01

第一部分：酒精發(fā)酵大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一雙酶法制備淀粉水解糖實(shí)驗(yàn)二淀粉水解糖含量定量分析實(shí)驗(yàn)三酵母活化和游離酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)酒精實(shí)驗(yàn)四固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)酒精實(shí)驗(yàn)五酒精蒸餾與酒精發(fā)酵液產(chǎn)物分析

第二部分：生物工程基本設(shè)備

實(shí)驗(yàn)六小型發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)與使用

組織安排1、每2～3人為一組（每班最多安排12組），自由組合，把組員姓名寫在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表上，講課完后統(tǒng)一交給指導(dǎo)老師。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，向指導(dǎo)老師領(lǐng)取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)單，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)填寫上去，指導(dǎo)老師簽名后才能結(jié)束實(shí)驗(yàn)。2、課前請做好預(yù)習(xí)，實(shí)驗(yàn)過程中要勤于思考，老師在指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)隨時(shí)提問；上課要準(zhǔn)時(shí)，不遲到早退；未經(jīng)指導(dǎo)老師批準(zhǔn)擅自離開實(shí)驗(yàn)室，以曠課計(jì)；遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度，每次做完實(shí)驗(yàn)要把本組臺(tái)面收拾干凈，用過的實(shí)驗(yàn)器皿清洗干凈放好，養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。每次實(shí)驗(yàn)安排的值日生要認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)場所的衛(wèi)生工作，完成值日工作后報(bào)告老師，經(jīng)同意方可離開。以上表現(xiàn)記入平時(shí)成績，占40%；操作規(guī)范和熟練程度、實(shí)驗(yàn)報(bào)告成績占60%。

組織安排（生技081）指導(dǎo)老師：粟桂嬌；閻欲曉助教：李才

生物工程實(shí)驗(yàn)室老師：李小梅、莫祺紅、黃熙時(shí)間（18周）內(nèi)容（1月4日）星期二：上午7:50起上課（全班）；糖化醪液的制備；酵母的活化、固定化（助教提前準(zhǔn)備2%氯化鈣溶液和無菌水）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；糖化醪液總糖和還原糖的測定；酵母的活化、游離酵母細(xì)胞接種和發(fā)酵；固定化酵母細(xì)胞清洗、接種（下午）（1月5日）星期三：上午7:50起上課（全班）；小型發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)與使用（分4批，每批8-9人）安排4批（1月6日）星期三：下午14:40起上課（全班）；酒精蒸餾及酒精發(fā)酵液產(chǎn)物分析（固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞發(fā)酵）

口試考核

組織安排（生技082）指導(dǎo)老師：粟桂嬌；閻欲曉助教：丁猛生物工程實(shí)驗(yàn)室老師：李小梅、莫祺紅、黃熙時(shí)間（19周）內(nèi)容（1月10日）星期一：上午7:50起上課（全班）；糖化醪液的制備；酵母的活化、固定化（助教提前準(zhǔn)備2%氯化鈣溶液和無菌水）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；糖化醪液總糖和還原糖的測定；酵母的活化、游離酵母細(xì)胞接種和發(fā)酵；固定化酵母細(xì)胞清洗、接種（下午）（1月11日）星期二：上午7:50起上課（全班）；小型發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)與使用（分4批，每批8-9人）安排4批（1月12日）星期三：下午14:40起上課（全班）；酒精蒸餾及酒精發(fā)酵液產(chǎn)物分析（固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞發(fā)酵）

口試考核

每組織基本實(shí)驗(yàn)耗材

1瓶/組試劑有：0.1mol/LHCl；6mol/LHCl；6mol/LNaOH；DNS試劑；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0mg/mL)；碘－碘化鉀溶液；0.1%酚酞指示劑；2%CaCl2溶液；

500mL燒杯1個(gè)/組；洗瓶1個(gè)/組；6孔白瓷板1塊/組；10mL移液管1支/組；10mL堿式滴定管；150mL三角瓶（活化酵母用）1個(gè)/組；150mL燒杯1個(gè)/組；6cm或9cm漏斗1個(gè)/組；滴定管架1臺(tái)/組；100mL量筒1個(gè)/組；500mL三角瓶（配無菌水)1個(gè)/組；50mL三角瓶1個(gè)/組；精密pH試紙(pH2.7～4.7)(pH3.8～5.4)(pH0.5～5.0)(pH5.4～7.0)各1本/組；小試管筐1個(gè)/2組玻璃棒2根/組；250mL容量瓶2個(gè)/組；250mL燒杯2個(gè)/組；塑料滴管2支/組；鐵架臺(tái)（帶鐵圈、鐵夾）2臺(tái)/組；250mL三角瓶3個(gè)/組（其中1個(gè)用來配2%CaCl2溶液）；試管1.8×18cm20支/組

0～100℃紅水溫度計(jì)1支/組；可調(diào)電爐1臺(tái)/組；石棉網(wǎng)1張/組

實(shí)驗(yàn)安全事項(xiàng)

滅菌鍋、電爐、烘箱、水浴等高溫避免燙傷濃硫酸、濃鹽酸腐蝕性強(qiáng)避免燒傷玻璃器皿避免割傷重視！

酒精發(fā)酵大實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品：酒精（乙醇）用途生產(chǎn)工藝化學(xué)合成法發(fā)酵法英文名稱：ethylalcohol;ethanol分子式：C2H5OH相對分子量：46.07

本實(shí)驗(yàn)主要以木薯淀粉為原料，采用游離酵母細(xì)胞和固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)酒精。

木薯淀粉為原料工藝流程如下：

釀酒活性干酵母→活化木薯淀粉→加水拌料→雙酶法水解制糖→發(fā)酵→蒸餾→酒精

釀酒活性干酵母→

活化→固定化細(xì)胞1.學(xué)習(xí)并掌握淀粉雙酶水解法制糖的原理及其操作工藝過程。2.掌握手持式折光儀測定糖含量的方法。

1雙酶法制備淀粉水解糖

1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡矸垭p酶水解法制糖的原理。手持式折光儀測定糖含量的原理。

1.2實(shí)驗(yàn)原理

目前，發(fā)酵工業(yè)所用的原料多以淀粉或糖質(zhì)為主，而許多微生物并不能直接利用淀粉。淀粉必須經(jīng)過水解制成淀粉糖以后才能被酵母菌等微生物所利用。

工業(yè)生產(chǎn)上將淀粉水解為葡萄糖的過程稱為淀粉的“糖化”，所制得的糖液稱為淀粉水解糖或糖化醪液。本實(shí)驗(yàn)采用雙酶法糖化制備糖化醪液，是以專一性很強(qiáng)的淀粉酶和糖化酶為催化劑，將淀粉水解為葡萄糖的方法。糖化醪液中主要的糖類是葡萄糖。淀粉雙酶水解法制糖的原理（C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6酸或酶淀粉的結(jié)構(gòu)支鏈淀粉淀粉是由許多葡萄糖基團(tuán)通過α-1,4-葡萄糖苷鍵聚合而成或通過α-1,6-糖苷鍵連接而成。直鏈淀粉還原末端非還原末端α-1,4糖苷鍵α-1,6糖苷鍵

液化：

α-淀粉酶（工業(yè)上稱為液化酶）作用于淀粉時(shí)，可以從分子內(nèi)部切開α-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生糊精、低聚糖和少量還原糖。淀粉雙酶水解過程包括液化和糖化兩個(gè)步驟。

糖化：

利用糖化酶將糊精及低聚糖水解為葡萄糖的過程。

淀粉水解速度主要與酶的用量、溫度和pH值有關(guān)。酶催化反應(yīng)對適合的溫度和pH值要求很高。

手持式折光儀測定糖含量的原理

通過手持式糖度計(jì)測含糖量，可快速了解淀粉水解制糖的進(jìn)程。

手持式折光儀，也稱糖鏡、手持式糖度計(jì)。

木薯淀粉，耐高溫α-淀粉酶（酶活2000U/g），糖化酶（10萬U/g），1mol/LHCl，1mol/LNaOH等

可調(diào)電爐，0～100℃紅水溫度計(jì)，0～32％手持式折光儀或0～80％手持式折光儀，恒溫水浴鍋等

500mL燒杯，玻璃攪拌棒，精密pH試紙，鏡頭紙，洗瓶,100mL量筒等1.3實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備1.4實(shí)驗(yàn)步驟100g木薯淀粉加水拌料(料：水=1：3）加入α-淀粉酶、CaCl2

調(diào)pH

？液化（溫度？）沸水浴蒸煮冷卻（溫度？）調(diào)pH

？加入糖化酶糖化降溫，調(diào)pH

糖化液量筒測量糖化液總體積V糖總（mL）

酒精發(fā)酵培養(yǎng)基（2瓶，120mL/瓶）手持糖量計(jì)測糖化液的含糖量；DNS法測定還原糖和總糖濃度1、記錄手持式折光儀測得的糖含量，參照說明書進(jìn)行溫度校正。2、雙酶水解制糖工藝中所選擇的溫度和pH的依據(jù)是什么？加入CaCl2有什么作用？3、目前常用的淀粉水解制糖的方法有哪幾種？雙酶法制糖的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？4、手持式折光儀測定糖含量的原理是什么？使用時(shí)有哪些注意事項(xiàng)？1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論討論：淀粉水解糖中，主要成分是什么，另外還有哪些雜質(zhì)？這些雜質(zhì)中，哪些微生物能直接利用，哪些不能？

在淀粉水解糖液中，主要糖分是葡萄糖，另外，根據(jù)水解條件的不同，尚有數(shù)量不等的少量麥芽糖及其他一些二糖、低聚糖等復(fù)合糖類。除此以外，原料帶來的雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂肪等）以及其分解產(chǎn)物也混入糖液中。葡萄糖、麥芽糖和蛋白質(zhì)、脂肪分解產(chǎn)物（氨基酸、脂肪酸等）等是生產(chǎn)菌生長的營養(yǎng)物在發(fā)酵中易被各種菌利用；而一些低聚糖類、復(fù)合糖等雜質(zhì)則不能被利用，它們的存在，不但降低淀粉的利用率．增加糧食消耗，而且常影響到糖液的質(zhì)量，降低糖液中可發(fā)酵成分。1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論討論：淀粉水解糖的制備方法及比較1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

用于制備淀粉的原料主要有薯類、玉米、小麥、大米等富含淀粉的農(nóng)產(chǎn)品。根據(jù)原料淀粉的性質(zhì)及采用的催化劑不同，淀粉水解為葡萄糖的方法有酸解法、酶解法以及酸酶結(jié)合法等三種。

1、酸解法

又稱酸糖化法，它是以酸為催化劑在高溫下將淀粉水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2、酶解法

酶解法是在酶的作用下進(jìn)行的，反應(yīng)條件較溫和，不需要耐高溫高壓或耐酸腐蝕的設(shè)備；酶作為催化劑的特點(diǎn)是專一性強(qiáng)，副反應(yīng)少，故水解糖液純度高，淀粉轉(zhuǎn)化率高；可在較高的淀粉乳濃度下水解。如酸解法一般使用10-12Bx（含18%--20%淀粉）的淀粉乳，而酶解法可用20—23Bx（含34%--40%淀粉）的淀粉乳，并且可以采用粗原料。用酶解法制得的糖液較純凈、顏色淺、無苦味、質(zhì)量高，有利于糖液的充分利用。

優(yōu)點(diǎn)討論：淀粉水解糖的制備方法及比較1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2、酶解法

缺點(diǎn)

酶解法反應(yīng)時(shí)間較長，設(shè)備要求較多，且酶是蛋白質(zhì)，易引起糖液過濾困難。當(dāng)然，隨著酶制劑生產(chǎn)及應(yīng)用技術(shù)的提高，酶解法制糖將逐漸取代酸解法制糖。

3、酸酶結(jié)合法

酸酶結(jié)合法是集中了酸解法和酶解法制糖的優(yōu)點(diǎn)而采用的生產(chǎn)方法，它又可分為：

酸酶法酶酸法討論：淀粉水解糖的制備方法及比較1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論4、淀粉水解糖制備方法比較

問題說說酸水解法、酸酶法和酶水解法三種不同水解工藝的優(yōu)劣？050溫度（oC）粘度(pas)不同水解工藝與糖化液的粘度的關(guān)系全酶酸酶酸

從制得的水解糖液的粘度來看，以酶解法為最低，酸解法最高，如圖所示。討論：淀粉水解糖的制備方法及比較從水解糖液的質(zhì)量、原料利用率、糖收得率、耗能及對粗淀粉原料的適應(yīng)情況來看，以酶解法最好，其次是酸酶法，酸法最差。從淀粉水解的整個(gè)過程所需的時(shí)間來看，酸法最短，酶法最長。

掌握還原糖和總糖的測定原理，復(fù)習(xí)用DNS比色法測定還原糖的方法。2淀粉水解糖含量定量分析

2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

3,5－二硝基水楊酸法（DNS法）定糖原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。

2.2實(shí)驗(yàn)原理

3,5－二硝基水楊酸（DNS）試劑；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.0mg/mL），6mol/LHCl，碘－碘化鉀溶液，6mol/LNaOH，1%酚酞指示劑等18mm×180mm試管，移液管10mL，50mL三角瓶，滴管，白瓷板，250mL容量瓶，100~1000μL移液槍，藍(lán)色槍頭盒等恒溫水浴鍋，分光光度計(jì)等

2.3實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別配制0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，分別加入DNS試劑2.0mL，于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，各加入蒸餾水9.0mL，搖勻，在540nm波長處測定吸光值OD540。（每組在此次實(shí)驗(yàn)過程中用同一支移液槍）測定前各臺(tái)儀器均用蒸餾水調(diào)零，然后再測各管樣液的吸光值。根據(jù)顯色顏色由淺到深測定。在測定過程中請不要按自動(dòng)校零鍵。注意分光光度計(jì)的規(guī)范操作。2.4實(shí)驗(yàn)步驟2.4實(shí)驗(yàn)步驟管號(hào)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）蒸餾水(mL)葡萄糖含量(mg/mL)OD5401和2010

3和40.20.80.4

5和60.40.60.8

7和80.60.41.2

9和100.80.21.6

11和12102以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Excel繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示方程和R平方值。2、糖化液中含糖量的測定

在測糖化液還原糖之前，先做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的稀釋倍數(shù)（稀釋倍數(shù)參考值：500倍)。注意取糖化液前要充分搖勻。具體操作步驟詳見講義。

2.4實(shí)驗(yàn)步驟糖化液還原糖非還原糖DNS法測定2.4實(shí)驗(yàn)步驟在測糖化液總糖