生物樣品的常用分析方法

體內(nèi)藥分專題之五——

生物樣品常見分析方法思考

1.在體內(nèi)藥物分析中所采用的生物樣品有哪些?2.最常用的生物樣品是什么?3.藥物分析中常見分析方法包括哪些?哪些適用于體內(nèi)藥物分析?

www。themegallery。com生物樣品的常用分析方法體內(nèi)藥物分析是借助于現(xiàn)代化的儀器與技術(shù)來分析藥物在體內(nèi)數(shù)量與質(zhì)量的變化，以獲得藥物在體內(nèi)的各種藥代動力學(xué)參數(shù)、代謝方式、代謝途徑等信息。目前，用于生物樣品分析的方法有很多，歸納起來主要有以下幾類：www。themegallery。com生物樣品的常用分析方法

1.色譜分析法2.光譜分析法3.免疫分析法

4.微生物分析法5.電化學(xué)分析法com色譜法(chromatography)

色譜法(chromatography)

一種物理或化學(xué)的分離分析方法，其分

離原理主要是利用物質(zhì)在流動相和固定相中的分配系數(shù)，或吸附能力的差異而達(dá)到分離。包括薄層色譜(TLC)，紙色譜(PC)，凝膠色譜，氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)。www。themegallery。com薄層色譜法

（thinlayerchromatography）是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。根據(jù)不同的分離機(jī)制，薄層色譜法可分為吸附薄層色譜、分配薄層色譜、離子交換薄層色譜和凝膠薄層色譜法等。www。themegallery。com薄層色譜法

（thinlayerchromatography）

分離速度快

優(yōu)點(diǎn)

檢出靈敏度高 選擇性好 顯色方便等缺點(diǎn)：對生物高分子分離效果不甚理想。www。themegallery。com薄層掃描法(TLCS)系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢查的方法。與高效液相色譜法相比，具有多通道效應(yīng)，可同時(shí)平行分離分析多個(gè)樣品；流動相用量少且選擇范圍寬、更換方便；固定相為一次性使用，對樣品的預(yù)處理要求不高等優(yōu)點(diǎn)。已成為薄層色譜常用的定量方法，在體內(nèi)藥物分析中廣泛應(yīng)用。www。themegallery。com薄層掃描法(TLCS)

采用TLCS法檢測患者血清中對乙酰氨基酚的濃度，為臨床急診中毒分析和血藥濃度監(jiān)測提供了快速簡便的方法。

該法板間測定誤差小、回收率高、線性范圍寬，能準(zhǔn)確測定患者血藥濃度。與文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC和GC法相比，具有簡便快速、樣品用量少、費(fèi)用低和不需要進(jìn)行衍生化等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)例：薄層掃描色譜法檢測血清中對乙酰氨基酚www。themegallery。com氣相色譜法

(gaschromatography，GC)定義：以氣體為流動相的的色譜法稱為氣相色譜法。分類：按固定相的聚集狀態(tài)：GSC、GLC按分離原理：GSC屬于吸附色譜、GLC屬于分配色譜按色譜操作形式：填充柱氣相色譜、毛細(xì)管柱氣相色譜。www。themegallery。com優(yōu)點(diǎn)：1.效能高neff可達(dá)103-106。2.靈敏度高檢測限可達(dá)納克級或更低。3.選擇性高固定相對性質(zhì)極為相似的組分，如烴類異構(gòu)體等有較強(qiáng)的分離能力。4.分析速度快一般的氣相色譜分析一次僅需幾分鐘。5.應(yīng)用范圍廣氣相色譜法廣泛應(yīng)用于氣體和易揮發(fā)性物質(zhì)或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性物質(zhì)的生物樣品的定性和定量分析。氣相色譜法

(gaschromatography，GC)www。themegallery。com氣相色譜法

(gaschromatography，GC)缺點(diǎn)：要求被測藥物及其代謝物必須具有一定的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。解決方法：固定相發(fā)展和衍生化試劑的廣泛使用，使生物樣品不再受限制。www。themegallery。com氣相色譜法

(gaschromatography，GC)

方法:樣品加入乙腈、渦旋混合、超聲提取、Florisil固相萃取柱凈化、氮吹，DB-17石英彈性毛細(xì)管柱30m(0.32mm，0.25μm)分離，氣相色譜電子捕獲檢測器(GC-ECD)檢測,保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果:方法最低檢出限為0.01ng/ml，樣品加標(biāo)回收率為80.1%~94.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%~4.8%。實(shí)例:氣相色譜法測定中毒病人血液中的溴氰菊酯氣相色譜法

(gaschromatography，GC)結(jié)論:

該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，檢出限低，適合中毒病人血液中溴氰菊酯含量的測定。www。themegallery。com定義www。themegallery。com高效液相色譜法優(yōu)點(diǎn)

以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，以微粒型填料作固定相，采用高壓送液泵和各種高靈敏度檢測器。

分離效能高檢測靈敏度高分析速度快選擇性好

適用范圍廣缺點(diǎn)www。themegallery。com高效液相色譜法

有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

分離方法www。themegallery。com高效液相色譜法www。themegallery。com高效液相色譜法主要根據(jù)是樣品的相對分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。色譜分離方法的選擇www。themegallery。com高效液相色譜法一、相對分子質(zhì)量

對于相對分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對分子質(zhì)量在200~2000的化合物，可用液-固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。www。themegallery。com高效液相色譜法二、溶解度

水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液-液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。www。themegallery。com高效液相色譜法三、化學(xué)結(jié)構(gòu)若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機(jī)螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液-液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于化合物；異構(gòu)體的分離可用液-固色譜法；具有不同官能團(tuán)的化合物、同系物可用液-液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。www。themegallery。com高效液相色譜法高效液相色譜法串聯(lián)紫外-熒光檢測器同時(shí)測定人血漿中對乙酰氨基酚與鹽酸曲馬多的濃度流動相，紫外-熒光檢測器串聯(lián)法同時(shí)在線檢測對乙酰氨基酚與曲馬多，紫外檢測波長:245nm；熒光激發(fā)波長:275nm，發(fā)射波長:304nm。20名健康志愿者服藥后,依據(jù)血漿中對乙酰氨基酚與曲馬多經(jīng)時(shí)血藥濃度,對2種制劑進(jìn)行了生物等效性研究。結(jié)果:本法中對乙酰氨基酚最低定量限為0.110μg/mL，線性范圍為0.11000～10.100μg/mL，日內(nèi)RSD為3.9%～8.0%，日間RSD為5.5%～6.7%；曲馬多最低定量限www。themegallery。com為10.03ng/ml，線性范圍為10.03～40110

ng/mL，日內(nèi)RSD為1.9%～5.9%，日間RSD為3.4%～7.3%。受試制劑中對乙酰氨基酚的相對生物利用度為(96.1±15.0)%，曲馬多的相對生物利用度為(93.9±15.3)%。結(jié)論:本方法操作簡便、靈敏度高，可用于臨床血藥濃度測定。受試制劑與參比制劑生物等效。www。themegallery。comwww。themegallery。com

膠束電動毛細(xì)管色譜(MECC)

在MECC體系中存在著以膠束形式存在的準(zhǔn)固定相和作為載體的液體流動相，膠束帶電荷在電場的作用下產(chǎn)生泳動，溶質(zhì)中各組分依據(jù)其在水相和膠束相之間的分配差異及在電泳和電滲流驅(qū)動下出現(xiàn)淌度差異而分離。優(yōu)點(diǎn)：手性拆分常用的分離模式之一，只需在背景電解質(zhì)中添加手性選擇劑，構(gòu)建手性環(huán)境，即可進(jìn)行手性拆分，本法適用于拆分人體內(nèi)的氨基酸。www。themegallery。com

膠束電動毛細(xì)管色譜(MECC)

渦流色譜技術(shù)(TFC)

渦流色譜技術(shù)是利用大粒徑填料使流動相在高流速下產(chǎn)生渦流狀態(tài)，從而對生物樣品進(jìn)行凈化與富集。優(yōu)點(diǎn):

可以在線處理生物樣品，速度快、選擇性好、靈敏度高，易于實(shí)現(xiàn)自動化，近年來在生物領(lǐng)域尤其是體內(nèi)藥物分析中得到了廣泛的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)：渦流色譜技術(shù)在生物樣品分析中的應(yīng)用劉朋，周建良，安婧婧，李萍，ChineseJournalofChromatography1

光譜法(Spectroscopy)

光譜法是基于檢測能量（電磁輻射）作用于待測物質(zhì)后產(chǎn)生的輻射信號或所引起的變化的分析方法。www。themegallery。com特點(diǎn)應(yīng)用于體內(nèi)藥物分析的光譜法比色法（COL）紫外分光光度法（UV）

熒光分析法（Fluorescencemethod）

原子吸收分光光度法（AAS）www。themegallery。comwww。themegallery。com一.比色法（COL）

屬于吸收光度法定量依據(jù)---Lambert-Beer定律A=ECL物質(zhì)在一定波長處的吸收度與其濃度成正比。比色法僅用于少數(shù)藥物濃度高，干擾成分少的生物樣品的測定。主要用于藥物監(jiān)測和人群代謝分型的測定，逐漸被現(xiàn)代色譜分析方法所取代。www。themegallery。com紫外分光光度法（UV）原理同比色法。適用于測定具有紫外吸收的藥物。體內(nèi)藥分中母體藥物與代謝物的紫外吸收光譜非常相似，易產(chǎn)生干擾。受靈敏度和選擇性的限制，其在體內(nèi)藥分中的應(yīng)用也呈下降趨勢。www。themegallery。com熒光分析法

（Fluorescencemethod）利用物質(zhì)經(jīng)光照射后能發(fā)射熒光的特性進(jìn)行分析的光學(xué)分析法。優(yōu)點(diǎn)：

1.靈敏度高。檢出限可達(dá)10-10g/ml~10-12g/ml。2.選擇性好。www。themegallery。com熒光分析法

（Fluorescencemethod）1.直接測定法

適于自身能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，因熒光性質(zhì)與溶液的pH有關(guān)，故熒光強(qiáng)度的測定須在適宜的pH介質(zhì)中進(jìn)行。(一)常規(guī)熒光分析法2.間接測定法

將無熒光或弱熒光物質(zhì)衍生化，測定衍生物熒光強(qiáng)度的方法。www。themegallery。com熒光分析法

（Fluorescencemethod）利用膠束溶液對熒光物質(zhì)的增溶、增敏和增穩(wěn)作用，大大提高熒光分析法的靈敏度和穩(wěn)定性。（二）膠束增溶增敏熒光分析法用β-CD單分子膠束熒光技術(shù)檢測秦艽中龍膽苦苷血藥濃度。龍膽苦苷嵌入β-CD的疏水空洞中，使其在膠束中溶解度增加和相互碰撞幾率減少，熒光量子效率提高，從而提高檢測靈敏度。www。themegallery。com熒光分析法

（Fluorescencemethod）（三）熒光探針分析法

使用熒光探針從無熒光的藥物制備有熒光的衍生物。優(yōu)點(diǎn)1增強(qiáng)待分析物質(zhì)的熒光響應(yīng)，提高檢測靈敏度和選擇性。2穩(wěn)定分析物，尤其針對活潑的和有揮發(fā)性的化合物。3有助于化合物基團(tuán)的確證。局限

衍生化增加分析步驟，易引入分析誤差。www。themegallery。com熒光分析法

（Fluorescencemethod）示例Tb-吡哌酸的熒光體系及尿和血清中吡哌酸含量的測定

應(yīng)用鑭系離子發(fā)光探針生成Tb-吡哌酸配合物，在紫外光照射下發(fā)生分子內(nèi)能量傳遞使Tb產(chǎn)生特征熒光，其熒光強(qiáng)度與吡哌酸濃度呈線性關(guān)系，從而建立一種靈敏、快速的分析吡哌酸的方法。4熒光分析法

（Fluorescencemethod）（四）熒光淬滅分析法

待分析的物質(zhì)能使某種熒光化合物的熒光淬滅，通過測量熒光化合物熒光的下降，間接測量該分析物質(zhì)。www。themegallery。com原子吸收分光光度法（AAS）

原子吸收分光光度法是基于蒸汽相中被測元素的基態(tài)原子對其原子共振輻射的吸收來測定樣品中該元素含量的一種方法。 原子吸收分光光度法在測定體液中微量金屬元素方面占有特殊的地位。www。themegallery。com原子吸收分光光度法（AAS）優(yōu)點(diǎn)：

靈敏度高，精密度好，選擇性好，應(yīng)用范圍廣，試樣用量少，簡便快速，易于自動化。局限性：

1.該法只能進(jìn)行無機(jī)元素的含量分析，不能直接用于有機(jī)化合物的含量分析和結(jié)構(gòu)分析；2.每測一種元素要更換一次空心陰極燈，不能同時(shí)進(jìn)行元素分析；3.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍窄，一般為一個(gè)數(shù)量級。www。themegallery。com原子吸收分光光度法（AAS）原子吸收分光光度計(jì)主要部件：

光源（空心陰極燈）原子化器單色器檢測系統(tǒng)www。themegallery。com原子吸收分光光度法（AAS）ab吸收光譜儀光源單色器樣品檢測器讀出器件原子化器單色器光電倍增管樣品空心陰極燈讀出器件www。themegallery。com原子吸收分光光度法（AAS）直接測定法

石墨爐原子吸收法測定大鼠血清、尿、膽汁和組織中的順鉑

間接測定法

尿樣中氨基多糖含量的測定www。themegallery。com免疫分析法www。themegallery。com放射免疫分析法(radioimmunoassay)

原理:放射性標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原（待測物）與不足量的特異性抗體競爭性地結(jié)合，反應(yīng)后分離并測量放射性而求得未標(biāo)記抗原的量。用反應(yīng)式表示為：

Ag+Ab=Ag-Ab+Ag*||Ag*-Abwww。themegallery。com

放射免疫分析法(radioimmunoassay)

1靈敏度高2特異性強(qiáng)3取樣量少，適用于大批量樣品的測定優(yōu)點(diǎn)：www。themegallery。com

放射免疫分析法(radioimmunoassay)

1需要用放射性同位素標(biāo)記抗原，其放射性對操作人員的健康、對環(huán)境的污染都會造成危害。2有時(shí)會出現(xiàn)交叉反應(yīng)、假陽性反應(yīng)。3需要有專用的同位素實(shí)驗(yàn)室及免疫測定儀器。缺點(diǎn)：www。themegallery。com

放射免疫分析法(radioimmunoassay)

應(yīng)用實(shí)例最典型的例子是：地高辛的血藥濃度測定www。themegallery。com酶免疫分析法

（enzymeImmunoassay）均相EIA非均相EIA

酶免疫分析法www。themegallery。com均相EIAwww。themegallery。com非均相EIAwww。themegallery。com酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

原理：

將特異的抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)和酶催化反應(yīng)相結(jié)合，以酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級免疫反應(yīng)。www。themegallery。com酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

ELISA是通過在合適的載體上，酶標(biāo)限定量抗原與未知抗原競爭固相抗體結(jié)合位點(diǎn)或固相抗原與未知抗原競爭限定量的標(biāo)記抗體結(jié)合位點(diǎn)，形成抗體復(fù)合物。在一定底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或還原成另一種帶色物質(zhì)。由于酶的降解底物與顯色是成正比的，通過肉眼觀察或分光光度計(jì)測定，從而確定是否存在未知抗原或含量。www。themegallery。com酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）▲應(yīng)用實(shí)例：《酶聯(lián)免疫分析法及其在食品農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用》武中平，徐春祥等酶免疫分析法檢測肝腎胰島細(xì)胞移植患者術(shù)后CSA濃度的臨床評價(jià)

溫冬梅，梁劍平，吳劍楊，龐嘉琳，李曼www。themegallery。com酶免疫分析法

（enzymeImmunoassay）酶標(biāo)記物是非放射性同位素，可避免對人體的放射性傷害和對環(huán)境的污染。酶標(biāo)記物比較穩(wěn)定，半衰期可超過一年。反應(yīng)不需溫育，均相EIA不需分離直接測定。反應(yīng)可用可見-紫外分光光度法測定。4123EIA優(yōu)點(diǎn)：www。themegallery。com酶免疫分析法

（enzymeImmunoassay）標(biāo)記酶不能像同位素標(biāo)記物和熒光標(biāo)記物那樣直接產(chǎn)生信號，須有其他試劑（酶底物、輔酶）的參與，才能完成酶反應(yīng)。EIA缺點(diǎn)：化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）

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化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）

是將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，借以檢測超微量物質(zhì)的一種分析技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分，即化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)和免疫反應(yīng)