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基于pcr方法鑒別蛇類藥材真?zhèn)纹返难芯?/p>

蛇藥一直是動物藥的重要組成部分。它經(jīng)常具有驅(qū)風、通絡、止痛的功效，臨床應用廣泛?！吨袊幍洹?010年版中共收載了3種蛇類藥材:烏梢蛇Zaocysdhumnades,金錢白花蛇Bungarusmulticinctus,蘄蛇Agkistrodonacutus。近年來,由于野生資源逐漸匱乏,加上價格昂貴,市場上出現(xiàn)蛇類偽品和混淆品甚多,且僅憑外部形態(tài)特征難以準確辨認。隨著分子鑒定技術的引入,藥典鑒別項下增加了烏梢蛇、蘄蛇的PCR鑒定,但由于藥典所載方法用時較長,無法適應當前中藥分子鑒定技術現(xiàn)場運用的需要。PCR作為分子生物學中應用最廣泛的技術之一,隨著研究和應用領域的不斷增長,存在著相當巨大的改進空間。自Millus等發(fā)明PCR技術以來,對PCR技術的改良從未停止過。Yap等通過調(diào)整PCR條件來縮短PCR反應時間。Wittwer等通過熱空氣注入法快速控溫,從而減少升降溫的時間,并提出了快速PCR(rapidPCR)的概念?？焖?、準確、高通量鑒別是現(xiàn)代中藥分子鑒別的核心需要,本文基于烏梢蛇、蘄蛇藥典PCR鑒定方法和已建立的金錢白花蛇PCR鑒定方法,對這3種蛇類藥材PCR鑒別技術的反應程序進行了優(yōu)化,建立了快速PCR鑒別方法,并引入了熒光染料法對真?zhèn)舞b別結(jié)果進行檢測,同時結(jié)合藥材DNA快速提取技術,可將蛇類藥材真?zhèn)舞b別時間控制在30min左右,為實現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用提供技術支撐。1材料表面1.1快速pcr研究選取來自于不同產(chǎn)地的11批烏梢蛇正品、12批金錢白花蛇正品、8批蘄蛇正品及其33批混偽品進行快速PCR研究。蛇類樣品收集自廣東、江西、北京、安徽等地區(qū),由中國食品藥品檢定研究院中藥標本館張繼研究員鑒定,憑證標本保存于中國中醫(yī)科學院中藥資源中心,見表1。1.2pcr擴增及成像系統(tǒng)GeneAmp9700型PCR擴增儀(AppliedBiosystem公司);TC-512梯度PCR儀(TECHNE公司);VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀(AppliedBiosystems公司);5810R型高速冷凍離心機(Eppendorf公司);VORTEX-2GENIE漩渦震蕩儀(Scientificindustries公司);DYY-12型電腦三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠);HE99X-15-1.5型電泳槽(Hoefer公司);SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)(GENE公司);ZF-7A型手持式紫外燈(上海谷村電子光學儀器廠)。2方法2.1pcr反應體系取20mg蛇類藥材粉末,使用堿裂解法提取總DNA,所提取DNA稀釋10倍用于PCR反應。通用引物對Cytb-H/Cytb-L用于PCR反應以檢測DNA質(zhì)量,25μLPCR反應體系,包含2.5μL10×buffer,1μL10mmol·L-1dNTPs,0.25μmol·L-1上游及下游引物、0.25USpeedStarHSTaqDNA聚合酶、1μL20%PVP40溶液、0.5μL10g·L-1BSA溶液、1μL(約10ng)DNA模板,反應程序見表2。2.2pcr反應及擴增取樣品DNA用于確定快速PCR反應條件。25μLPCR反應體系,包含2.5μL10×buffer,1μL10mmol·L-1dNTPs,0.25μmol·L-1上游及下游引物,0.25USpeedStarHSTaqDNA聚合酶、1μL20%PVP40溶液、0.5μL10g·L-1BSA溶液、1μL(約10ng)DNA模板。PCR反應在GeneAmp9700型PCR擴增儀上進行,初始反應程序見表2。反應結(jié)束后取PCR反應產(chǎn)物5μL,加入2μL6×Loadingbuffer(Takara公司)混勻后于EB染色的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。分別利用蛇類特異性鑒別引物對WuShao-F/WuShao-R,JinQian-F/JinQian-R,QiShe-F/QiShe-R進行PCR反應,并考察退火溫度:61,63,65,67,69,71℃(烏梢蛇,蘄蛇);60,62,64,66,68,70℃(金錢白花蛇);PCR循環(huán)數(shù):30,28,26,24,22個循環(huán);變性溫度:94,92,90,88,86,84℃;變性和退火時間:20,10,5,3,1s;Taq酶種類:rTaqDNA聚合酶,SpeedStarHSTaqDNA聚合酶,AptaTaqfastDNA聚合酶Mix,TransfastTaqDNA聚合酶;不同PCR儀:9700型PCR儀(ABI公司),VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀(AppliedBiosystems公司),TC-512型PCR儀(TECHNE公司)。2.3pcr產(chǎn)物檢測在PCR擴增產(chǎn)物中加入2μL100×SYBRGreenI于365nm紫外波長下檢測熒光,出現(xiàn)綠色熒光則表明存在陽性擴增產(chǎn)物。3結(jié)果與分析3.1dna質(zhì)量檢測由于堿裂解法提取的DNA無法通過凝膠電泳檢測,本文使用通用引物進行擴增,以檢測所獲得DNA質(zhì)量。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明,利用Cytb-H/Cytb-L引物,3種蛇類藥材及其20個混淆品均獲得約400bp大小的擴增產(chǎn)物,見圖1,說明堿裂解法提取的DNA可以滿足PCR反應的要求。3.2不同條件對pcr擴增效果的優(yōu)化為建立準確、快速、簡便的蛇類藥材分子鑒別方法,本文對已報道的PCR反應體系進行了優(yōu)化,在最初的25μLPCR反應體系中加入1μL20%PVP40溶液、0.5μL10g·L-1BSA溶液,可顯著增加PCR反應的成功率。由于Yap等研究表明,低溫預變性(92℃1min)即可實現(xiàn)全基因組解鏈并能增加PCR產(chǎn)物得率,且本課題組前期證實94℃預變性1min即可實現(xiàn)PCR產(chǎn)物的有效擴增,因此本文把PCR初始程序設計為94℃預變性1min,從94℃變性開始,兩步法,30個循環(huán),并開展PCR反應條件的優(yōu)化。在此基礎上進一步依次對PCR反應過程中退火溫度、變性溫度、變性和退火時間、循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化,并分析了Taq酶種類及不同的PCR儀對改良后PCR反應穩(wěn)定性的影響。對烏梢蛇快速PCR反應條件進行優(yōu)化,使用GeneAmp9700型PCR擴增儀、TC-512梯度PCR儀均可,反應參數(shù)為88℃預變性1min后,88℃10s,63℃10s,26個循環(huán),見圖2。金錢白花蛇快速PCR變性時間可以減至1s,但變性1s時,退火時間低于20s無法獲得有效擴增。金錢白花蛇快速PCR反應參數(shù)為88℃預變性1min后,88℃5s,62℃5s,28個循環(huán),見圖3。蘄蛇快速PCR反應參數(shù)為88℃預變性1min后,88℃3s,63℃3s,26個循環(huán),見圖4。3.3快速pcr和紫外熒光檢測分別選擇優(yōu)化的蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇快速PCR反應參數(shù),對3種蛇類藥材及其18種混偽品進行快速PCR擴增,在擴增產(chǎn)物中加入2μL100×SYBRGreenI,在365nm紫外波長下進行熒光檢測。結(jié)果表明,正品顯示出明亮綠色熒光,而偽品不發(fā)出熒光,見圖5。4動物類藥材鑒定難本實驗主要針對藥典收載的3種蛇類藥材,建立快速PCR鑒別方法,經(jīng)DNA提取、PCR擴增、熒光檢測3步驟,在30~45min可完成藥材真實性快速鑒別,有利于實現(xiàn)中藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用。目前動物類中藥材鑒定,尤其是現(xiàn)場鑒定,主要還是依賴傳統(tǒng)性狀和理化鑒別,其針對形狀完整、真?zhèn)纹坊瘜W組成相差較大的樣品鑒別確實更直接、簡便。但大部分動物類藥材多以粉末或成藥方式入藥;且存在外部形態(tài)被破壞、組織細胞特征不夠明顯、化學成分無明顯差異等鑒定難點,需要依靠經(jīng)驗豐富的專業(yè)人才;由于目前動物藥鑒定和分類學的專業(yè)人員較少,傳統(tǒng)中藥鑒定難免存在主觀性強、重復性和穩(wěn)定性差等缺陷等問題。經(jīng)典PCR鑒定技術恰好擁有準確、專屬性強、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,但由于其自身操作相對復雜、單次反應耗時較長,難以用于中藥材現(xiàn)場鑒別?？焖貾CR技術可在確保PCR反應靈敏度和特異性的前提下盡可能縮短PCR時間、提高檢測效率,在臨床檢驗和司法檢測中已應用廣泛[16,17,18,19,20,21]?？焖貾CR可以通過對經(jīng)典PCR反應條件進行優(yōu)化,結(jié)合DNA快速提取技術和熒光檢測技術,操作簡單、結(jié)果判讀明確,在動物類藥材的鑒定中具有很強優(yōu)勢,也適用于真?zhèn)舞b定試劑盒的開發(fā),有助于實現(xiàn)中藥材準確、快速、現(xiàn)場鑒定。1.3taqna聚合酶瓊脂糖購自Promega公司;溴