柴胡藥材中總皂苷的含量測(cè)定

柴胡藥材中總皂苷的含量測(cè)定

柴胡，真名胡，是波形科植物柴胡d.或窄葉柴胡b.unifoliumscor世代gilfoliumwd的干燥根。按性狀不同,分別習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”。北柴胡主產(chǎn)于河北、河南、陜西等地,南柴胡主產(chǎn)于吉林、江蘇、安徽等地?！吨袊?guó)植物志》記載,我國(guó)有柴胡屬植物36種、17個(gè)變種、7個(gè)變型,具有疏散退熱,舒肝解郁,升舉陽(yáng)氣之功能,為中醫(yī)治療少陽(yáng)癥的首選要藥,是河北道地藥材之一。柴胡化學(xué)成分復(fù)雜,主要含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖類等。藥理研究表明,柴胡具有解熱、抗病毒、降血脂、保肝、抗炎、抗腫瘤等作用。由于藥品流通市場(chǎng)柴胡使用品種混亂,且采收時(shí)間跨度較長(zhǎng),所以不同來(lái)源的柴胡所含皂苷類成分含量差異較大。本文建立了紫外分光光度法測(cè)定柴胡中總皂苷及HPLC法測(cè)定柴胡皂苷a、d的方法,對(duì)13批采自太行山區(qū)的柴胡樣品進(jìn)行定量分析,為評(píng)價(jià)太行山區(qū)柴胡質(zhì)量?jī)?yōu)劣提供數(shù)據(jù)。1儀器和試劑盒1.1超聲清理器型SartoriusBS110S精密天平;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清理器;RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;UVmini-1240紫外分光光度計(jì);島津LC-10ATvpPlus高效液相色譜儀,包括:二元泵,柱溫箱;Phenomenex預(yù)柱。1.2對(duì)照品乙腈一種價(jià)值柴胡皂苷a對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批號(hào):11052402),柴胡皂苷d對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批號(hào):12020301);德國(guó)Merck公司色譜乙腈;其他試劑均為分析純。1.3總皂苷及柴胡皂苷a、d含量測(cè)定柴胡藥材由人工在河北、河南、山西當(dāng)?shù)夭杉?經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)張丹雁教授鑒定為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根。對(duì)13批柴胡樣品進(jìn)行總皂苷及柴胡皂苷a、d的含量測(cè)定。產(chǎn)地及來(lái)源見(jiàn)表1。2方法和結(jié)果2.1總羥基含量測(cè)定2.1.1紫外-可見(jiàn)分光光度法參考相關(guān)文獻(xiàn),精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各0.2mL,加入1%對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1mL,70℃溫?zé)?0min,取出放冷,加入磷酸4.0mL,70℃反應(yīng)30min,照紫外-可見(jiàn)分光光度法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅤA)于400~800nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(圖1)。結(jié)果在545nm左右有最大吸收峰,故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為545nm。因柴胡藥材中柴胡皂苷d含量大于柴胡皂苷a含量,故以柴胡皂苷d作為研究指標(biāo)進(jìn)行總皂苷含量的測(cè)定。2.1.2超聲法提取溶劑取柴胡樣品和對(duì)照藥材粉末(過(guò)四號(hào)篩)0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別加入5%濃氨水試液的甲醇溶液25mL,密塞,30℃水溫超聲處理30min,濾過(guò),用甲醇分2次洗滌容器及藥渣,洗液與濾液合并,回收溶劑至干。殘?jiān)由倭克芙?再用飽和正丁醇提取,合并正丁醇液,用水洗滌2次,每次20mL,棄去水液,回收正丁醇至干,甲醇溶解,并定容至5mL,搖勻,作為供試品溶液。2.1.3對(duì)照溶液的制備2.1.4對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液吸光度的測(cè)定分別精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL至1mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻。精密吸取對(duì)照品溶液各0.2mL,分別加入1%對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1mL,70℃溫?zé)?0min,取出放冷,加入磷酸4.0mL,70℃反應(yīng)30min,放冷,在波長(zhǎng)545nm處分別測(cè)定吸光度值。以柴胡皂苷d質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x),吸光度值為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:y=6.4410x-0.0225,r=0.9969。結(jié)果顯示,柴胡皂苷d在0.03256~0.16280mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.1.5精密度實(shí)驗(yàn)取同一份的柴胡皂苷d溶液,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”操作,重復(fù)測(cè)定5次,吸光度平均值為0.459,RSD為1.51%,表明儀器精密度良好。2.1.6穩(wěn)定性測(cè)定取11號(hào)樣品制成的供試品溶液,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”操作,分別于配制后0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定吸光度平均值為0.656,RSD為1.16%,表明本品在2.5h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。2.1.7回收率與精密度取11號(hào)樣品,平行6份,按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液和“2.1.4”項(xiàng)下方法操作,測(cè)定吸光度平均值為0.635,RSD為2.06%,表明本法具有良好的重現(xiàn)性。2.1.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱定已知含量的11號(hào)樣品6份,分別精密加入一定量的柴胡皂苷d溶液,按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液和“2.1.4”項(xiàng)下方法操作,測(cè)得平均加樣回收率為99.73%,RSD為2.07%,表明總皂苷回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表2。2.1.9總皂苷含量測(cè)定分別取13批樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩),按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依“2.1.4”項(xiàng)下方法操作,記錄吸光度值,并計(jì)算樣品中總皂苷的含量,結(jié)果見(jiàn)表3。2.2柴胡a、d含量的測(cè)定2.2.1流動(dòng)相、柱溫度色譜柱:AgilentZORBAXEclipseXDB-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-水;流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210nm;柱溫:30℃;梯度洗脫:0~50min:25%~90%(A);50~55min:90%(A)。在此色譜條件下,樣品分離良好。見(jiàn)圖2。2.2.2超聲法提取溶劑取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25mL,密塞,30℃水溫超聲處理30min,濾過(guò),用甲醇20mL分2次洗滌容器及藥渣,洗液與濾液合并,回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙?轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。2.2.3對(duì)照溶液的制備精密稱取柴胡皂苷a1.29mg,柴胡皂苷d1.19mg,分別置5mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取柴胡皂苷a、d對(duì)照品溶液0.1,0.25,0.5,0.75,1mL,分別加甲醇定容至刻度,搖勻。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積值。以柴胡皂苷a、d的進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo),峰面積值Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:柴胡皂苷a:Y=142840X-6110.6,r=0.9996,柴胡皂苷a在0.258~2.580μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;柴胡皂苷d:Y=170759X-1637.5,r=0.9997,柴胡皂苷d在0.238~2.380μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.2.5儀器精密度試驗(yàn)精密吸取柴胡皂苷d對(duì)照品溶液10μL,重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定峰面積平均值為400858.8,柴胡皂苷d的RSD為1.64%,表明儀器精密度良好。2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果精密稱取11號(hào)樣品制成的供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件操作,分別于0、2、4、6、12、24h進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果表明,柴胡皂苷a的RSD為1.82%,柴胡皂苷d的RSD為1.58%,表明本品24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.2.7方法的重現(xiàn)性精密稱取11號(hào)樣品6份,分別按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液,依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件操作,結(jié)果表明,柴胡皂苷a的RSD為1.18%,柴胡皂苷d的RSD為1.03%,表明方法重現(xiàn)性良好。2.2.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱定已知含量的11號(hào)樣品6份,分別精密加入一定量的柴胡皂苷a、d對(duì)照品溶液,分別按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液,依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件操作,計(jì)算回收率,柴胡皂苷a的平均回收率為100.40%,RSD為1.72%;柴胡皂苷d的平均回收率為99.70%,RSD為1.50%。2.2.9組樣品含量測(cè)定分別取13批樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄柴胡皂苷a、d的峰面積,并計(jì)算其含量,結(jié)果見(jiàn)表3。3討論3.1產(chǎn)品吸收波長(zhǎng)的選擇比較香草醛-高氯酸顯色法和對(duì)二甲氨基苯甲醛-磷酸顯色法發(fā)現(xiàn),香草醛-高氯酸顯色法下供試品與對(duì)照品在相同波長(zhǎng)下沒(méi)有共同吸收峰,而對(duì)二甲氨基苯甲醛-磷酸顯色法下供試品與對(duì)照品在相同波長(zhǎng)(545nm)下有共同吸收峰,且吸光度值正常,故選擇對(duì)二甲氨基苯甲醛-磷酸顯色法。3.2柴胡皂苷a、d和總皂苷的含量太行山區(qū)不同采收時(shí)間的柴胡樣品中總皂苷及柴胡皂苷a、d的含量相差比較大,柴胡皂苷a、d高者,總皂苷不一定高,反之亦然。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出,5號(hào)和6號(hào)樣品中總皂苷及柴胡皂苷a、d三者含量均很低,低于《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定“柴胡中柴胡皂苷a和d的總量不得少于0.30%”,因此,其藥用價(jià)值值得商榷。10號(hào)樣品中柴胡皂苷柴胡皂苷a和d的總量為0.34%,總皂苷含量達(dá)到1.14%;而13號(hào)樣品總皂苷含量為0.87%,柴胡皂苷a和d的總量達(dá)到0.71%。所以,應(yīng)綜合考察柴胡皂苷a、d及總皂苷三者的含量來(lái)評(píng)價(jià)柴胡的質(zhì)量,只有三者均高才是質(zhì)量最佳。本實(shí)