中藥dna分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)驗(yàn)證與內(nèi)容探討

中藥dna分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)驗(yàn)證與內(nèi)容探討

中醫(yī)dna分子的識(shí)別方法在中醫(yī)偽造鑒定和基本原型的方面呈現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。將祁山和五尖蛇的識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)納入中國(guó)藥典2010年版，將川貝母的識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)納入中國(guó)藥典2010年版第一補(bǔ)充版。中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)研究越來(lái)越得到重視,許多中藥品種已經(jīng)完成了標(biāo)準(zhǔn)研究與草案起草。通過(guò)對(duì)一些標(biāo)準(zhǔn)草案的復(fù)核發(fā)現(xiàn),這些標(biāo)準(zhǔn)的起草說(shuō)明主要是針對(duì)實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證,包括不同人員、儀器、實(shí)驗(yàn)室之間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性考察,方法的適用性驗(yàn)證等,引物設(shè)計(jì)的科學(xué)性有必要的證據(jù)說(shuō)明,但大多缺乏充分證據(jù)予以論證。因此,本文對(duì)物種多樣性以及中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)研究方法與內(nèi)容進(jìn)行了探討,希望能給中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)研究的科學(xué)性提供參考和借鑒。1中醫(yī)藥dna的分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)和物種1.1標(biāo)準(zhǔn)是否科學(xué)中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)是利用特異性引物以及基因組中一段相對(duì)較短的DNA條帶進(jìn)行中藥基原鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)研究所依據(jù)的基原樣品的DNA信息達(dá)到對(duì)中藥基原物種整個(gè)樣本的全部樣品進(jìn)行鑒別,并排除基原以外的任何物種(近緣種與偽品)的目的。標(biāo)準(zhǔn)研究所依據(jù)樣品的DNA變異能否代表中藥基原物種的全部DNA變異范圍是標(biāo)準(zhǔn)是否科學(xué)的關(guān)鍵。中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)與DNA條形碼分子鑒定法的最大區(qū)別是:中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)使用特異性的引物,保證只有中藥基原物種擴(kuò)增出DNA條帶,近緣種與偽品不能擴(kuò)增出DNA條帶或能擴(kuò)增但不被特異性酶切;DNA條形碼使用通用引物,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序得到的DNA序列與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì),按相似性程度鑒定物種。DNA條形碼更具容錯(cuò)性,能保證在一定范圍內(nèi)即使DNA序列存在變異的物種也能被正確地鑒定。中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)頒布后要被無(wú)數(shù)次地重復(fù)執(zhí)行,如果標(biāo)準(zhǔn)方法操作復(fù)雜,檢測(cè)成本高,會(huì)影響標(biāo)準(zhǔn)的可行性和實(shí)用性。所以,標(biāo)準(zhǔn)研究應(yīng)盡可能科學(xué)與規(guī)范,并使作為研究成果的標(biāo)準(zhǔn)本身具備方法專屬、操作簡(jiǎn)便、成本低廉的特點(diǎn)。已頒布的蘄蛇、烏梢蛇飲片、川貝母分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)所用的基因序列具有提取簡(jiǎn)單、擴(kuò)增容易、重現(xiàn)性好的特點(diǎn),但標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性從起草說(shuō)明的論述中難以進(jìn)行判斷,故仍有待驗(yàn)證。1.2物種間的雜交與最佳鑒別分類學(xué)種(也有人稱形態(tài)學(xué)種)僅憑外觀形態(tài)特征就能進(jìn)行物種辨認(rèn),這種物種概念能滿足多種實(shí)際用途的需要,但劃分的物種多少會(huì)帶有分類學(xué)專家個(gè)人的主觀理解,這也是生物科學(xué)領(lǐng)域中分類學(xué)種受到批評(píng)的主要原因。1942年,Mayr提出了生物學(xué)種概念,此概念應(yīng)用于植物界卻碰到了許多意想不到的問題,例如無(wú)法在標(biāo)本館或野外判斷具體的物種是否為生物學(xué)種,一些無(wú)性繁殖的物種每個(gè)個(gè)體都生殖隔離,這些都影響了生物學(xué)種在實(shí)際工作中的應(yīng)用。目前大多數(shù)植物系統(tǒng)學(xué)或分類學(xué)家仍然應(yīng)用著形態(tài)-地理學(xué)種(分類學(xué)種)的概念,中藥學(xué)領(lǐng)域也使用這種物種概念。有些物種既是分類學(xué)種又是生物學(xué)種的為理想種(或同質(zhì)種),即在形態(tài)表現(xiàn)型和基因型上同質(zhì),彼此之間完全雜交可育;和類群外成員則在表現(xiàn)型和基因型上不同質(zhì),彼此之間不能互交。如銀杏(GinkgobilibaL.)、杜仲(EucomiaulmoidesOliver)等為典型的理想種。有研究表明動(dòng)物中52.1%,植物中52.8%的分類學(xué)種為理想種,其中蕨類植物比例最高。中藥基原物種明確是DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)研究制定的前提,但中藥的基原物種明確只是在國(guó)際植物命名法規(guī)的框架下,物種名稱與范圍不存在爭(zhēng)議,不等于物種內(nèi)部遺傳上同質(zhì)。物種內(nèi)部存在DNA遺傳變異是物種進(jìn)化的原因,沒有DNA遺傳的多樣性就沒有生物多樣性。目前,我國(guó)中藥基原物種的DNA分子鑒定研究基礎(chǔ)薄弱,基原物種的基因型是否同質(zhì)缺乏判斷依據(jù)或研究資料,許多中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)研究仍然需要補(bǔ)充中藥基原物種的DNA分子研究資料,對(duì)物種概念以及遺傳變異有一些了解將有助于對(duì)物種變異的處理。1.3物種鑒別標(biāo)準(zhǔn)我國(guó)為構(gòu)建植物DNA條形碼提出了“關(guān)于植物DNA條形碼研究技術(shù)規(guī)范”,DNA條形碼中的種子植物物種名稱統(tǒng)一以《FloraofChina》為準(zhǔn),苔蘚植物的物種鑒定名稱以《BryophyfloraofChina》為準(zhǔn),其他孢子植物以現(xiàn)有《中國(guó)孢子植物志》為準(zhǔn)。中藥應(yīng)用與鑒定由于學(xué)科的特殊性,使用的物種名稱參考依據(jù)與《FloraofChina》有時(shí)略有差異。中國(guó)藥典2010年版一部凡例第十七條規(guī)定:植物拉丁學(xué)名的主要參照依據(jù)為《FloraofChina》和《中國(guó)高等植物》等。中國(guó)藥典2010年版一部收載的植物拉丁名的調(diào)整原則為:以前版本收載的拉丁學(xué)名與《FloraofChina》學(xué)名不同,且只有在《FloraofChina》和《中國(guó)植物志》中此種植物的拉丁學(xué)名相同時(shí)進(jìn)行調(diào)整。也就是說(shuō)中藥基原的學(xué)名仍然有一些與《FloraofChina》和《中國(guó)植物志》收載的學(xué)名不同,或?qū)W名雖同,但物種范圍不同。中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)收載的物種名稱與《FloraofChina》,以及正在構(gòu)建的iFlora中的DNA條形碼中的植物名稱存在差異時(shí),物種名稱與范圍界定必須符合中國(guó)藥典品種項(xiàng)下規(guī)定。例如蒼術(shù)為蒼術(shù)[Atractylodeslancea(Thunb.)DC.]或北蒼術(shù)[A.chinensis(DC.)Koidz.]的根莖?！禙loraofChina》把關(guān)蒼術(shù)(A.japonicaKoidz.)歸并入蒼術(shù)種內(nèi)做異名處理,植物蒼術(shù)的DNA條形碼包含了植物關(guān)蒼術(shù)的DNA分子序列。由于關(guān)蒼術(shù)的根莖一直作蒼術(shù)的偽品處理,所以植物關(guān)蒼術(shù)的DNA分子序列應(yīng)排除在中藥材蒼術(shù)DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)之外,夏枯草、白芷、牡丹皮等也存在類似情況。有鑒于此,中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)研究在引用物種DNA序列作為參考資料時(shí),必須首先厘清基原物種的名稱與范圍,以免使用同名異物的DNA序列,避免標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行中發(fā)生假陽(yáng)性的結(jié)果。2中藥基原的遺傳多樣性檢驗(yàn)中藥DNA分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)研究的依據(jù)樣品以DNA序列用分子系統(tǒng)學(xué)方法(比如NJ、UPGMA等)建立系統(tǒng)樹,建樹的目的并不是利用DNA序列重建系統(tǒng)發(fā)育樹,而是為了檢驗(yàn)中藥基原的單系性或是否有隱種存在,即基原的不同個(gè)體能否緊密聚類到一起,以此決定標(biāo)準(zhǔn)采用何種方法。在充分收集代表性樣品的基礎(chǔ)上,篩選基原與近緣種、偽品之間有足夠遺傳間斷(DNAGap),又能包容中藥基原內(nèi)全部遺傳分化的DNA序列,在DNA序列上確認(rèn)專屬性的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn),再根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物應(yīng)用于鑒別標(biāo)準(zhǔn)中。特異性引物設(shè)計(jì)的科學(xué)性決定了標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性。2.1植物dna條碼檢測(cè)方法中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)中引物的設(shè)計(jì)研究,首先需要構(gòu)建一個(gè)能完全體現(xiàn)種內(nèi)變異和種間分化的完整的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)作為參考。然而,目前應(yīng)用DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定研究的種間遺傳間斷往往基于不完全的種內(nèi)變異(許多種實(shí)際取樣為1~2個(gè)個(gè)體)和種間分化(不完全的或地理局限的物種取樣)。這種不完全的取樣在應(yīng)用DNA條形碼進(jìn)行的中藥分子鑒別中表現(xiàn)尤其突出,往往1個(gè)物種只有1份樣品就進(jìn)行條形碼鑒別中藥的研究。此外,如果僅僅對(duì)中藥基原物種樣品進(jìn)行分子分類學(xué)研究,以及引物設(shè)計(jì)難以保證分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性,必須對(duì)中藥基原、地方習(xí)用品與近緣種進(jìn)行廣泛的取樣才能保證標(biāo)準(zhǔn)中的引物設(shè)計(jì)的科學(xué)性。中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)研究制定時(shí),每個(gè)基原物種需要多少樣品才能保證標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性尚沒有明確的證據(jù)。但采集的樣品數(shù)量與物種的分布范圍相關(guān),物種的分布范圍越廣,則需要采集的樣品數(shù)量越多,這樣才能最大限度地代表物種的遺傳變異范圍。采樣時(shí)考慮模式標(biāo)本產(chǎn)地和居群概念,注重近緣種材料也非常重要,并應(yīng)充分利用國(guó)內(nèi)標(biāo)本館和博物館體系。植物DNA條形碼每個(gè)物種需要的樣品建議數(shù)為8~12個(gè)個(gè)體,且至少來(lái)自5個(gè)不同的地域或居群,每個(gè)居群采集樣品2份,2份樣品間應(yīng)保持一定的距離,形態(tài)特征上也要具有代表性。而中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)由于缺乏容錯(cuò)性的特點(diǎn),采集范圍與標(biāo)本數(shù)量應(yīng)比植物DNA條形碼研究采集的樣本量多一些,特別是在物種分布區(qū)的邊緣更應(yīng)多采樣品。除非有確切的DNA序列資料供參考引用,可以適當(dāng)減少采樣量;建議其他近緣種、地方習(xí)用品每個(gè)物種不少于2個(gè)居群,每個(gè)居群2份標(biāo)本,并收集商品藥材與混偽品進(jìn)行驗(yàn)證,以保證結(jié)果的正確。2.2pcr擴(kuò)增檢測(cè)擴(kuò)增序列我國(guó)植物DNA條形碼研究逐漸得到推廣,該技術(shù)可以在大范圍內(nèi)對(duì)67%以上的植物物種進(jìn)行鑒定。中藥依據(jù)正在研究的DNA條形碼(COI、rbcL、matK、trnH-psbA和ITS序列)資料,以及美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank)收載的DNA序列資料,可以比較容易地獲得一些DNA序列信息作為參考,能部分彌補(bǔ)我國(guó)物種遺傳多樣性研究基礎(chǔ)較為薄弱的缺陷。在設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)中的引物時(shí),由于種間雜交、基因或染色體突變與加倍等因素,經(jīng)常導(dǎo)致物種內(nèi)發(fā)生遺傳分化,使篩選特異性的DNA序列難度加大。例如在對(duì)菝葜(SmilaxchinaL.)的matK、ITS和trnT-L序列進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)廣西居群與其他地區(qū)居群存在遺傳分化,細(xì)胞學(xué)分析確認(rèn)菝葜存在2、4、6倍體現(xiàn)象,廣西居群為異源4倍體;對(duì)何首烏(PolygonummultifloraThunb.)的psbA-trnH、matK序列進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)種內(nèi)產(chǎn)生了與地理相關(guān)的遺傳分化;鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)的ITS序列分析發(fā)現(xiàn)種下存在H型與F型類群的遺傳分化,但H型或F型類群內(nèi)ITS序列相同,類群間ITS和5.8S區(qū)存在SNP位點(diǎn)。當(dāng)單基原的樣品以一種DNA序列不能被歸為一類時(shí),應(yīng)選擇其他的DNA序列,如同篩選植物DNA條形碼序列那樣,直至基原被歸為一類,在確認(rèn)專屬性的SNP位點(diǎn)后設(shè)計(jì)特異引物用于標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)單基原中藥的物種內(nèi)存在遺傳分化且未發(fā)現(xiàn)有能把樣品歸為一類的DNA序列時(shí),也可把有遺傳分化的單基原中藥假設(shè)成2個(gè)基原的中藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方法的設(shè)計(jì)。例如,把人參與西洋參假設(shè)為一種新中藥的2個(gè)基原,則人參與西洋參的DNA分子鑒定方法就具有參考引用價(jià)值:以ITS及5.8S基因篩選的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的1對(duì)特異引物,利用接頭引物介導(dǎo)的等位基因特異性擴(kuò)增法(ALM-ASA)檢測(cè),經(jīng)1次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),人參擴(kuò)增出294bp條帶,西洋參擴(kuò)增出111bp條帶,根據(jù)片段的大小即可分別鑒別人參與西洋參;利用人參與西洋參18S和marK基因篩選的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)2對(duì)特異引物,經(jīng)多重等位基因特異擴(kuò)增(MAS-PCR),經(jīng)1次PCR反應(yīng),人參擴(kuò)增出249bp條帶,西洋參擴(kuò)增出1049bp條帶,根據(jù)片段的大小即可鑒別人參與西洋參;利用GenBank中人參和西洋參ITS2基因的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的1對(duì)特異引物,人參與西洋參都能擴(kuò)增出248bp的序列,利用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SS-CP)方法檢測(cè)ITS2序列中單堿基的差異,人參的單鏈DNA比西洋參的電泳距離遠(yuǎn),且與各自的對(duì)照藥材譜帶一致,1次反應(yīng)即可鑒別人參和西洋參。2.3sa所需基因在川貝母屬類病毒屬中的擴(kuò)增和鑒別多基原中藥的物種之間如果親緣關(guān)系較近,有時(shí)可歸為一大類。例如中國(guó)藥典2010年版一部收載的川貝母基原有川貝母(FritillariacirrhosaD.Don)、暗紫貝母(F.unibracteataHsiaoetK.C.Hsia)、甘肅貝母(F.przewalskiiMaxim.)、梭砂貝母(F.delavayiFranch.)、太白貝母(F.taipaiensisP.Y.Li)或瓦布貝母[F.unibracteataHsiaoetK.C.Hsiavar.wabuensis(S.Y.TangetS.C.Yue)Z.D.Liu,S.WangetS.C.Chen]共5種1變種。ITS2基因序列分析發(fā)現(xiàn),川貝母基原的樣品被聚為一支,明顯與川貝母的同屬混淆品存在區(qū)別,相當(dāng)于川貝母基原為單系發(fā)生;同樣,以ITS1序列分析也發(fā)現(xiàn)川貝母基原被聚為一支,且在ITS1序列中均有限制性內(nèi)切酶SmaI的酶切位點(diǎn),而川貝母的同屬混淆品無(wú)SmaI的酶切位點(diǎn),此SmaI酶切位點(diǎn)可用于鑒別川貝母類和非川貝母類藥材,此方法已應(yīng)用于川貝母分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)。此外,2個(gè)基原的黃芪、3個(gè)基原的甘草與大黃,以及半夏與掌葉半夏也有相似的成功報(bào)道。多基原中藥的多個(gè)物種如果以某個(gè)DNA序列不能被歸為一類時(shí),即不能被歸為單系發(fā)生時(shí),應(yīng)另選DNA序列進(jìn)行研究,直至被歸為一大類;或參考有遺傳分化的單基原中藥,如把人參與西洋參當(dāng)成一種新的多基原中藥品種設(shè)計(jì)特異引物,以達(dá)到鑒別多基原中藥的目的。除了異屬多基原(如小木通、水蛭等)中藥較難制定1種DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)外,其他中藥品種,不論基原內(nèi)物種是否存在遺傳分化,均以制定一種鑒別標(biāo)準(zhǔn)為佳。3中藥dna分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)研究的必要性及應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)在中藥DNA分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)草案復(fù)核時(shí)發(fā)現(xiàn),一些標(biāo)準(zhǔn)的引物設(shè)計(jì)無(wú)視物種內(nèi)DNA序列變異,不考慮近緣種DNA序列情況,有的以Genbank序列為基礎(chǔ)進(jìn)行