蝴蝶蘭的快速無性繁殖

蝴蝶蘭的快速無性繁殖孫佳林(東北業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱150030)摘要：以蝴蝶蘭(Phalaenopsis)的花梗側(cè)芽及花序頂端為外植體，在Kyoto或MS+BA3ppm培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出營養(yǎng)芽。以試管植株的莖尖、莖段、葉片在MS4-BA0.5-5ppm或Ms+BAO.5-5ppra4-NAAlppm的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)出不定芽或原球莖狀體(Protoeorm?Like-Body,PLB.)在附加BA54-NAAl的培養(yǎng)基里，莖段不定芽誘導(dǎo)率為65,葉片PLB誘導(dǎo)率為16.7%，用MS+BA1ppm進(jìn)行LIj繼代培養(yǎng)可獲得大量群體，進(jìn)一步培養(yǎng)可形成完整小苗。由蝴蝶蘭花梗側(cè)芽而來的白花無性系品種(Pha1.(phylliskeyxbandleader)xcetebration?巳大量出瓶穢栽。在廣州地區(qū)，蝴蝶蘭出瓶苗種植23年即可開花。蝴蝶蘭形態(tài)美妙，色彩鮮麗，花期持久，在熱帶蘭中，素有“蘭花皇后”的美稱，在花卉市場上，是一種商氆商品蘭花。蝴蝶蘭量墮萎性氣生蘭，疆株上極少發(fā)育例枝，比其他種類的蘭花更難于進(jìn)行常規(guī)無性繁殖。組織培養(yǎng)是建立蝴蝶蘭快速繁殖無性系的重要手段。在蝴蝶蘭的無性繁殖方面，據(jù)報(bào)道1949年Rotor成功地在試管中培養(yǎng)出花梗苗。但大量的應(yīng)用研究是在六十年代以后，尤其是七十年代至八十年代(4-187。所選用外植體材料有花梗倒芽、莖、葉片、根尖等。方法各異，難度各有高低。我國除臺灣省的林金其、林瑞松等也對蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)作了認(rèn)真的研究外(1、z、11),其他地方尚未見有報(bào)道。本研究在研究期問，曾進(jìn)行了花梗例芽誘導(dǎo)營養(yǎng)芽｝不定芽增殖j莖尖、莖段、葉片原球莖狀體(PLB)誘導(dǎo)｝PLB增殖J完整植株培養(yǎng)等試驗(yàn)。材料與方法1.1材料t蝴蝶蘭雜交科-：Phal。(phytli,~keyxbandleader)Xcelebration(白花)，Phal。hyd(黃花)，PTI『.hyhrid(紅花)1.2外植體及消毒剪取正在開花或開花后的花梗，剝除已開放的花朵及花莆，用漂粉精溶液(15片/tOOm1)消毒20—30分鐘，剝?nèi)グ~，露出側(cè)芽，再消毒5分鐘，無擅水沖洗5—6次。1.3蘭接種和培養(yǎng)將消毒后的花梗，切成2?3cm長的切段，每段帶一側(cè)芽'花序頂端則切成約。6era長短，基部向下插于培養(yǎng)基上。培養(yǎng)室溫度為25±l°C,光照度'5001x,光照10h/d。營養(yǎng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：A.Kyoto培養(yǎng)基。Hypoaex(7一6一19)花寶1號3g，瓊脂I2g，胰蛋白胨2g，水10們I，蔗糖36g，PH=s.o—5。13.MS+B'Agpprn。1.4試驗(yàn)程序：外植體一營養(yǎng)芽誘導(dǎo)a—不定芽一增殖一長根一完整植株一出瓶b—莖頭一PLA誘導(dǎo)一增殖一完整小苗一出瓶c—莖段一PLA誘導(dǎo)一增殖一完整小苗一出瓶d—嫩葉片一PLA誘導(dǎo)一增殖一完整小苗一出瓶2結(jié)果2.1花梗側(cè)芽和頂弗的誘導(dǎo)本試驗(yàn)的目灼是使休眠的花梗側(cè)芽和頂芽啟動，形成營養(yǎng)芽，在試管內(nèi)長成無菌植棟，便于進(jìn)一步利用。應(yīng)黽A、B兩種培養(yǎng)基作為營養(yǎng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，接種七天左右，側(cè)芽膨大并向外伸長，30天后長出小葉50天左右可長出4?5片l咔。這時(shí)，花梗組織及植株基部均變黑色，所分泌的代謝物質(zhì)將培養(yǎng)基染成黑色。培養(yǎng)基上的植株雖然生長良好，但應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上。在A培養(yǎng)基上，例芽多長成單椿小苗。在B培養(yǎng)基上，刪芽可萌發(fā)廢叢生芽（圖版一1）?；ㄐ蝽敹诵⊙康膯觿t比較慢，40—5。天后，才見小葉伸出。2.2不定芽的誘導(dǎo)及增殖將試管內(nèi)植株切離花梗，將莖段橫切為上、下兩段，轉(zhuǎn)入附加BA或BA+NAA的MS培養(yǎng)基中，約30天左右，小芽及莖段的基部膨大并長出不定芽，son左右幼芽長大，可將幼芽切離，繼續(xù)接種于培養(yǎng)基中增殖叢芽（圖版一2），周而復(fù)始，可得較大數(shù)量的叢生芽在MS+BA3ppm培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)率為50。在MS+BAs+NAAt培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)率達(dá)65%（表1）統(tǒng)計(jì)不定芽的年增殖率，鑄果表明，以50天為一周期，每芽增殖芽數(shù)=342（x）±0。69（s）即每芽年增殖數(shù)上限為19810撐，下限為1130（置信度a=95%）2.3原球鎣狀體的誘導(dǎo)莖尖誘導(dǎo)原球莖狀體，在雙目解剖鏡下剝?nèi)≡嚬苤仓甑那o。取下的莖尖直徑約0.m，接種｛：Ms+DA3ppm培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)，l4天后觀察，肉限可見莖尖膨大，呈淺綠色半球狀，直徑約1.5mm。三個(gè)礙后，長成的桑果狀原球莖狀體組織塊直徑約6mm（圖版一3）。用葉片和莖段誘導(dǎo)原球莖狀體，將試管植株的嫩葉片整塊或橫切成上、中，下三段｝同樣，將試管植株的莖段整株或橫切成上、中、下三段，分別接種在培養(yǎng)基上?；九囵B(yǎng)基為Ms,附加不同濃度的BA稠NAA。接種后20天，可見葉片彎曲，近離培養(yǎng)基的切口出現(xiàn)愈仿組織微粒，而接觸培養(yǎng)基的切口則分泌出黑色代謝物質(zhì)，但I(xiàn)~-,q'仍保持綠色，幾乎維持5—6個(gè)月才逐漸褐化（此現(xiàn)象與林金其c：）在花梗節(jié)闖切片培養(yǎng)中所觀察的情況相似）。只有極個(gè)別的嫩葉片基部或斷裂1=I呈現(xiàn)凹凸不平，逐漸出現(xiàn)愈傷組織狀的早期原球莖狀體（圖版一4）。莖切段的培養(yǎng)情況與上述情況相似，但愈傷組織多在接近培養(yǎng)基處或深埋培養(yǎng)基處出現(xiàn)。接種90天后調(diào)查，143個(gè)葉片外植體中只有9個(gè)外植體出現(xiàn)愿球莖狀體，總誘導(dǎo)率為6.3。l6o個(gè)莖段外植休中，有14個(gè)出現(xiàn)原球莖狀體，總誘導(dǎo)率為8.8，但有37個(gè)莖段出現(xiàn)不定芽，不定芽的總誘導(dǎo)率為23。附加不同激素對莖段和葉片原球莖狀體和不定芽誘導(dǎo)率曲影響（表1）。表1附加不同激聖對醐幌蘭莖段和葉片原球莖狀體和不定旁誘異率（嗾I的彬響附加激累（mg/L）莖切段PLB莖切段叢生芽葉片PLB形成數(shù)/外植悴數(shù)誘導(dǎo)率形成數(shù)/外植休數(shù)誘拆率形咸數(shù)/外植休數(shù)誘導(dǎo)率BAO30/2100/2100/180BA10/1502/1513.31/IS5.5BA33/22611/2250.02/16J2.5BA53/1816.73/1816,71/2050BA0.5+NAA14/2020.01/205.00/190BAI+NAA11/147.1Q/1401/263.8BA3+NMI2/306.77/3023.31/812.5+NAA1-L/205.013/2065.U3/L816.72.4原球莖狀體的增殖早期原球莖狀體外觀像愈傷組織，表面球狀物不明顯。繼續(xù)培養(yǎng)，可見表面突起一：個(gè)千圓球，部分表面細(xì)胞分化出根毛狀物。如果不切割原球莖狀體，讓它們在不含或只含低濃度細(xì)胞激動素的培養(yǎng)基里繼續(xù)生長，60天后陸續(xù)長出芽，成為完整的原球莖。100天后，大部分已長成有2—3片葉的小苗。為達(dá)到大量繁殖韻目的，必須加快原球莖增殖速度。在原球莖狀體階段進(jìn)行增殖是最理想的，原球莖狀體形成君，在無苗條件下取出切成小塊，轉(zhuǎn)移到MS+BA1ppm培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。在切塊細(xì)小，稀疏的培養(yǎng)瓶內(nèi)，群體生長較慢，而在切塊較大且密集的培養(yǎng)瓶里，群體生長十分旺盛，表現(xiàn)出一定的群體生長效應(yīng)（圖版5）2.5不同培養(yǎng)基對小苗長根的影響表2不同培養(yǎng)基對糊蝶蘭苗長根的影響培養(yǎng)基4周10周調(diào)查楞數(shù)長根棵數(shù)生根率（馮）關(guān)査株數(shù)任根棟數(shù)主根率他）Kyoio231082.6123229565MS+IAAO.L26g30.772B1760.71MS+1BA0.128932,14251352.002.6試管苗的出瓶移栽及開花情況在廣州地，蝴蝶蘭的試管苗出瓶移栽可在3-10月進(jìn)行，以4—6月出瓶效果雖好。出瓶時(shí)，甩清水將附在小苗根上的培養(yǎng)基洗凈，然后移植在干凈的水苔或椰糠上，放置陰涼濕潤通風(fēng)處，一個(gè)月后，開始噴施液肥待小苗新葉長出時(shí)，移植到小盆或蕨板上：出瓶后的楦株一般兩年即可Jf花該無性系花色潔白，花型豐滿，花期持久，每杖花花期均長達(dá)60天以上?；◤郊s8Cm。第二年和第三年開花枝每枝有5—7朵花，隨著植株的年齡增長，每枝花的朵數(shù)增多。該無性系后代保持了原母株的優(yōu)良特性。（圖版?7、8）3.討論3.1蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，適于以花梗作為外植沐建立快速繁殖無性系。其優(yōu)點(diǎn)是不損母株，開花后取材，對母抹曲整體情況得以了鱘。特別是從外地弓I入的新品種，可以待植株開花后，確定其觀賞價(jià)值后再進(jìn)行大量繁殖。3.2蝴蝶蘭花軸基部的芽往往l為休眠芽，花序頂端則含有未完全分化的花原始侔，本試驗(yàn)使休眠芽啟動，使頂端向營養(yǎng)芽轉(zhuǎn)化，均未通過脫分化過程形成愈傷組織，之后如采用叢生芽方式增殖，盡管增殖系數(shù)較低，但對減少變異，保持母株特性是有利的。3.3花軸基部的休眠芽有兩種發(fā)育可能，一是長成幼小植株，二是長成花枝?；üh芽的分化方向受翎芽的發(fā)育程度、溫度、激素等諸因素影響。低溫有可能導(dǎo)致體眠芽向花芽分化作者在1988年2、3月接種的-}it花梗側(cè)芽，受較低溫度影響（15—22oC）,結(jié)泉太部分發(fā)育成花芽這些花芽繼續(xù)培養(yǎng)35天，待花梗長度約2.5—3.5cin時(shí)，將其切成段，在較高的溫度下（23-26~C）繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果，新花梗上的節(jié)問側(cè)芽又長成了營養(yǎng)芽田中道男等的研究表明［9），當(dāng)培養(yǎng)溫度為28°C時(shí)，花梗側(cè)芽向營養(yǎng)芽分化，在20~C的低溫下，則多數(shù)伸長成為花芽。附加細(xì)胞激動素6BA，有利于花梗側(cè)芽萌發(fā)，向叢生芽方向發(fā)展。以花梗側(cè)芽為外植體建立無性系目的在于取得營養(yǎng)植株，建議培養(yǎng)條件采用溫度25—28C，光照15001X,并在培養(yǎng)基中附加1—3ppm的BA。3.4目前開花的植株均為確基芽苗，因而變異不大。山葉片和莖段脫分化產(chǎn)生愈傷組織形成