蛋白質(zhì)分子量測定

蛋白質(zhì)分子量測定方法目前，蛋白質(zhì)分子量測定的常用方法主要有四種：年度法、凝膠過濾層析法、凝膠電泳法和凝膠滲透色譜(GPC)法。一、 粘度法一定溫度條件下，高聚物稀溶液的粘度與其分子量之間呈正相關(guān)性，隨著分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通過測定高聚物稀溶液粘度隨濃度的變化，即可計算出其平均分子量(粘均分子量)。該方法操作簡單、設(shè)備價格較低，通常不需要標(biāo)準(zhǔn)樣品，但無法測定聚合物的分子量分布。粘度法所需設(shè)備：恒溫槽、烏倍路德粘度計。二、 凝膠過濾層析法在凝膠色譜柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其滲入凝膠微孔的能力不同而在柱中得以分離。分子量較大的分子，滲入凝膠微孔較淺，隨洗脫液流動速度較快，因而先流出色譜柱；相反，分子量較小的聚合物分子后流出。通過測定從進(jìn)樣到聚合物分子流出色譜柱期間流過凝膠柱的洗脫液的體積，并與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，即可計算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。凝膠層析技術(shù)操作方便，設(shè)備簡單，樣品用量少，而且有時不需要純物質(zhì)，用一粗制品即可，目前已得到相當(dāng)廣泛的應(yīng)用。凝膠層析法測定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范圍內(nèi)，線性關(guān)系比較好，但在極端pH時，一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量超過5%時，測得分子量比真實的要大，鐵蛋白則與此相反，測得的分子量比真實的要小。凝膠過濾層析法所需設(shè)備：層析柱、紫外分光光度計。三、 SDS濮膠電泳法SDS是十二烷基硫酸鈉的簡稱，它是一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而使其電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，于是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)和遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得未知物的分子量。SDS-凝膠電泳法是目前蛋白質(zhì)分子量測定中使用最廣泛的方法，實驗成本較低，儀器設(shè)備也相對很簡單，一套電泳裝置即可。一般涉及到蛋白質(zhì)純化的實驗室基本都具備。但是精確程度相對較低，好的電泳圖譜需要一定的技術(shù)。SDS-凝膠電泳法所需設(shè)備：微型凝膠電泳裝置、電源（電壓200V,電流500mA）。四、 凝膠滲透色譜法凝膠滲透色譜法的分離原理與凝膠過濾層析法相同，只是利用高校液相色譜技術(shù)實現(xiàn)凝膠層析法分離和測定過程。與凝膠過濾層析法相比凝膠滲透色譜法分離速度快、分析時間短、重現(xiàn)性好，但設(shè)備投入較大，價格較高。凝膠滲透色譜法所需設(shè)備：高效液相色譜儀、溶劑脫氣設(shè)備、溶劑過濾器、樣品過濾器件。其中高效液相色譜儀可選用如下兩種系統(tǒng)之一；溶劑脫氣設(shè)備可選用超聲波清洗器：江蘇昆山KQ-100E。兩種備選高效液相色譜系統(tǒng)大連伊利特P230型等度系統(tǒng)基本配置：P230型高壓恒流輸液泵：1臺UV230+型紫外可見檢測器：1臺Rheodyne7725i高壓六通進(jìn)樣閥：1只EC2000單通道色譜數(shù)據(jù)處理工作站：1套色譜柱：根據(jù)測定蛋白質(zhì)的分子量不同選?。勺稍兩V儀器公司）。島津高效液相色譜儀LC-10Avpplus（蘇州島津）基本配置LC-10ATVPPlus輸液泵：1臺SPD-10AVPPlus紫外可見雙波長檢測器：1臺LCsolutionLite中文化LC工作站：1套CBM-10AVPPlus系統(tǒng)控制器：1臺高壓六通進(jìn)樣閥：1只色譜柱：根據(jù)測定蛋白質(zhì)的分子量不同選?。勺稍兩V儀器公司）。、粘度法原理分子量是表征化合物特征的基本參數(shù)之一。但高聚物分子量大小不一，參差不齊，一般在103?107之間，所以通常所測高聚物的分子量是平均分子量。高聚物在稀溶液中的粘度，主要反映了液體在流動時存在著內(nèi)摩擦。在測高聚物溶液粘度求分子量時，常用到下面一些名詞。忠詞符號物理意文純?nèi)軇┱扯热軇┓肿优c洛劑分子間的內(nèi)摩擦表現(xiàn)出來的粘度“洛液粘度7溶劑分子與溶列分子間、高分子與高分于鍵和高分子與洛劑分子之閭’三者內(nèi)摩擦的綜合表現(xiàn)。相對粘度串一踽客溶液粘度對溶劑粘度的相對值。增比粘度加=傘一1高分子與高分子2問純?nèi)軇┡c高分子之何的內(nèi)摩擦效應(yīng)比濃粘度單位濃度下所顯示出的粘度特性粘度17]反映高務(wù)于與溶劑分于之間的內(nèi)理擦如果高聚物分子的分子量愈大，則它與溶劑間的接觸表面也愈大，摩擦就大表現(xiàn)出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之間的經(jīng)驗關(guān)系式為：[7]=KMa； (1)式中，M為粘均分子量；K為比例常數(shù)；a是與分子形狀有關(guān)的經(jīng)驗參數(shù)。K和a值與溫度、聚合物、溶劑性質(zhì)有關(guān)，也和分子量大小有關(guān)。K值受溫度的影響較明顯，而a值主要取決于高分子線團(tuán)在某溫度下，某溶劑中舒展的程度，其數(shù)值解在0.5?1之間。K與a的數(shù)值可通過其他絕對方法確定，例如滲透壓法、光散射法等，從粘度法只能測定[刃。在無限稀釋條件下(2)獲得W]的方法有二種：一種是以n/C對C作圖，外推到C-0的截距值；另一種sp是以ln“/C對C作圖，也外推到C-0的截距，兩根線會合于一點。方程為：r晉二［"］_0［打C：測定粘度的方法主要有毛細(xì)管法、轉(zhuǎn)筒法和落球法。在測定高聚物分子的特性粘度時，以毛細(xì)管流出法的粘度計最為方便。若液體在毛細(xì)管粘度計中，因重力作用流出時，可通過泊肅葉公式計算粘度。(m=1)。對于某一只指定的粘度計而言，(4)可以寫成下式省略忽略相關(guān)值，可寫成：式中，t為溶液的流出時間；t0為純?nèi)軇┑牧鞒鰰r間?？梢酝ㄟ^溶劑和溶液在毛細(xì)管中的流出時間，從(6)式求得nr，再由圖求得［處2.儀器恒溫槽1套；烏倍路德粘度計1只；移液管(10mL)2只，(5mL)1只；秒表,吸耳球，螺旋夾；橡皮管；步驟(以聚丙烯酰胺分子量測定為例)測定所用的烏倍路德粘度計，又叫氣承懸柱式粘度計。他的最大優(yōu)點是可以在粘度計里逐漸稀釋從而節(jié)省許多操作手續(xù)。．先用洗液將儀器洗凈，再用自來水、蒸餾水分別沖洗幾次，每次都要注意反復(fù)流洗毛細(xì)管部分，洗好后烘干備用。.調(diào)節(jié)恒溫槽溫度至3O.OO°C，在粘度計的B管和C管上都套上橡皮管，然后將其垂直放入恒溫槽，使水面完全浸沒G球。．溶液流出時間的測定。用移液管分別吸取已知濃度的聚丙烯酰胺溶液10mL和硝酸鈉溶液(3mol?dm-3)5mL，由A管注入粘度計中，在C管處用洗耳球打氣，使溶液混合均勻，濃度記為C],恒溫10min,進(jìn)行測定。測定方法如下：將C管用夾子夾緊使之不通氣，在B管用吸耳球?qū)⑷芤簭腇球經(jīng)D球、毛細(xì)管、E球抽至G球2/3處，解去夾子，讓C管通大氣，此時D球內(nèi)的溶液即回入F球，使毛細(xì)管以上的液體懸空。毛細(xì)管以上的液體下落，當(dāng)液面流經(jīng)a刻度時，立即開始計時，當(dāng)液面降至b刻度時，停止計時，測得刻度a,b之間的液體流經(jīng)毛細(xì)管所需時間。重復(fù)這一操作三次，它們間相差不大于0.3s，取三次的平均值為q。然后依次由A管用移液管加入5mL,5mL,5mL,5mL硝酸鈉溶液(1mol?dm-3)，將溶液稀釋，使溶液濃度分別為c2,c3,c4,c5，用同法測定每份溶液流經(jīng)毛細(xì)管的時間t2，t3,t4,t5。應(yīng)注意每次加入硝酸鈉溶液后，要充分混合均勻，并抽洗粘度計的E球和G球，使粘度計內(nèi)溶液各處的濃度相等。．溶劑流出時間的測定用蒸餾水洗凈粘度計，尤其要反復(fù)流洗粘度計的毛細(xì)管部分。用1mol?dm-3的硝酸鈉洗1?2次，然后由A管加入約15mL1mol?dm-3硝酸鈉溶液。用同法測定溶劑流出的時間t0。數(shù)據(jù)記錄(1)．?dāng)?shù)據(jù)記錄實驗溫嗖30度00373聚內(nèi)烯坯加沫度(1)．?dāng)?shù)據(jù)記錄實驗溫嗖30度00373聚內(nèi)烯坯加沫度0.002g-JinL0.66(2)．作圖由回歸直線截矩得［n］二(3)．由公式代入數(shù)據(jù)得[7]=KM°咼聚物溶劑t/°C103Kdm^kg-ia分子量范圍MX10-4聚丙烯酰胺水306.310.802?50水30680.661?20ImoLdm-3NaNO33037.50.66聚丙烯腈二甲基甲酰胺2516.60.815?27聚甲基丙烯酸甲酯苯253.80.7924?450丙酮257.50.703?93聚乙烯醇水25200.760.6?2.1水3066.60.640.6?16聚苯乙烯甲苯25170.691?160聚己內(nèi)酰胺40%H2SO42559.20.690.3?1.3聚醋酸乙烯酯丙酮2510.80.720.9?2.5摘自:印永嘉主編.大學(xué)化學(xué)手冊.山東科學(xué)技術(shù)出版社.1985:692二、凝膠過濾層析法1.原理：凝膠層析法(即凝膠過濾法，gelfiltration)是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法，又叫做分子篩層析法(molecularsievechromatography)，排阻層析法(exclusionchromatography)。凝膠本身是一種分子篩，它可以把分子按大小不同進(jìn)行分離，好象過篩可以把大顆粒與小顆粒分開一樣。但這種“過篩”與普通的過篩不一樣。將凝膠顆粒在適宜溶劑中浸泡，使充分吸液膨脹，然后裝入層析柱中，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫，在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，流速緩慢，以致最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離。凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，不論是天然凝膠還是人工合成凝膠，它們的內(nèi)部都具有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠層析法常用的天然凝膠是瓊脂糖凝膠(agarosegel，商品名Sepharose)，人工合成凝膠是聚丙烯酰胺凝膠(商品名為Bio-gel-P)和葡聚糖(dextran)凝膠，后者的商品名稱為Sephadex型的各種交聯(lián)葡聚糖凝膠，它是個有不同孔隙度的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，不溶于水。這種聚合物的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小與被分離物質(zhì)分子的大小有相應(yīng)的數(shù)量級。在凝膠充分溶脹后，交聯(lián)度高的，孔隙小，只有相應(yīng)的小分子可以通過，適于分離小分子物質(zhì)。相反，交聯(lián)度低的孔隙大，適于分離大分子物質(zhì)。利用這種性質(zhì)可分離不同分子量的物質(zhì)。為了說明凝膠層析的原理，將凝膠裝柱后，柱床體積稱為“總體積”，以Vt(totalvolume)表示。實際上Vt是由V。，Vi與Vg三部分組成，即：Vt=Vo+Vi+VgV。稱為“孔隙體積”或“外體積"(outervolume)又稱“外水體積”，即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積，相應(yīng)于一般層析法中柱內(nèi)流動相的體積；Vi為內(nèi)體積(innervolume)，又稱“內(nèi)水體積”，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積，相應(yīng)于一般層析法中的固定相的體積，它可從干凝膠顆粒重量和吸水后的

重量求得；Vg為凝膠本身的體積，因此Vt—Vo等于Vi+Vg。它們之間的關(guān)系可l u 丄 ￡用圖17-3表示。洗脫體積（Ve,elutionVolume）與Vo及Vi之間的關(guān)系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve為洗脫體積，自加入樣品時算起，到組分最大濃度（峰）出現(xiàn)時所流出的體積；Kd為樣品組分在二相間的分配系數(shù)，也可以說Kd是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配系數(shù)。它只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮》植加嘘P(guān)，而與柱的長短粗細(xì)無關(guān)，也就是說它對每一物質(zhì)為常數(shù)，與柱的物理條件無關(guān)。Kd可通過實驗求得，上式可改寫成：上式中Ve為實際測得的洗脫體積；V?？捎貌槐荒z滯留的大分子物質(zhì)的溶液（最好有顏色以便于觀察，如血紅蛋白，印度黑墨水，分子量約200萬的藍(lán)色葡聚糖-2000等）通過實際測量求出；V.可由g?WR求得（g為干凝膠重，單位為克；WR為凝膠的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，對一層析柱凝膠床來說，只要通過實驗得知某一物質(zhì)的洗脫體積Ve，就可算出它的Kd值。頃it￡貝涇聽學(xué)址職的兀勲疔吊童圖幾直乳於祥粗沁4R,r,u.v.u.f；嗽前許怕曲1Jfrin的詵舅斡烈Kd可以有下列幾種情況：1、 當(dāng)Kd=0時，則Ve=V。。即對于根本不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的大分子物質(zhì)（全排阻），洗脫體積等于空隙體積（圖中組分I）。2、 當(dāng)Kd=1時，Ve=Vo+V.。即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時，洗脫體積應(yīng)

為空隙體積與內(nèi)體積之和（圖中組分III）?？梢钥闯觯瑢δ骋荒z介質(zhì)，兩種全排出的分子即Kd都等于零，雖然分子大小有差別，但不能有分離效果。同樣兩種分子如都能進(jìn)入內(nèi)部空隙，即Kd都等于1,它們既使分子大小有不同，也沒有分離效果。因此不同型號的凝膠介質(zhì)，有它一定的使用范圍。3、 當(dāng)0VKdV1時，Ve=Vo+KdVj。表示內(nèi)體積只有一部分可被組分利用，擴散滲入，Ve即在V°+Vj之間變化（圖中組分II）。4、 有時Kd>1,表示凝膠對組分有吸附作用，此時Ve>Vo+Vj。例如一些芳香族化合物的洗脫體積遠(yuǎn)超出理論計算的最大值，這些化合物的Kd>1。如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸在SephadexG-25中的Kd值分別為1.2，1.4和2.2。在實際工作中，對小分子物質(zhì)也得不到Kd=1的數(shù)值，特別是交聯(lián)度大的凝膠差別更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。這是由于一部分水相與凝膠結(jié)合較牢固，成為凝膠本身的一部分，因而不起作用，小分子不能擴散入內(nèi)所致。此時Vi即不能以g?WR計算，為此也常有直接用小分子物質(zhì)D2O,NaCI等通過凝膠柱而由實驗計算出Vi值的。另一個解決的辦法是不使用Vj與Kd，而用Kav（有效分配系數(shù)）代替Kd，其定義如下：已知殆」"丁匕丿，將齊一爲(wèi)代替環(huán)則：心=（"；-蔦） 生物秀實驗頻道以（匕—）WWW.bblOO.COHl即F尹卡⑴—叫）在這里實際上將原來以水作為固定相（Vj）改為水與凝膠顆粒（V—Vo）作為固定相，而洗脫劑（Ve—V。）作為流動相。Kav與Kd對交聯(lián)度小的凝膠差別較小，而對交聯(lián)度大的凝膠差別大。在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用時，當(dāng)流動相流過Vt體積后，所有的組分都應(yīng)該被洗出來，這一點為凝膠層析法的特點，與一般層析方法不同。Ve與分子量的關(guān)系：對同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關(guān),流過凝膠柱時，按分子量大小順序流出，分子量大的走在前面。Ve與分子量的關(guān)系可用下式表示：Ve=K1—K2logMrK1與K2為常數(shù)，Mr為分子量，Ve也可用Ve—V。（分離體積），Ve/V。（相對保留體積），Ve/Vt（簡化的洗脫體積，它受柱的填充情況的影響較小）或Kav代替，與分子量的關(guān)系同上式，只是常數(shù)不同。通常多以Kav對分子量的對數(shù)作av圖得一曲線，稱為“選擇曲線”，如下圖所示。曲線的斜率是說明凝膠性質(zhì)的一個很重要的特征。在允許的工作范圍內(nèi)，曲線愈陡，則分級愈好，而工作范圍愈窄。凝膠層析主要決定于溶質(zhì)分子的大小，每一類型的化合物如球蛋白類，右旋糖酐類等都有它自己的特殊的選擇曲線，可用以測定未知物的分子量，測定時以使用曲線的直線部分為宜。用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)的分子量，方法簡單，技術(shù)易掌握，樣品用量少，而且有時不需要純物質(zhì)，用一粗制品即可。例如在一粗酶制劑中，為了測定某一酶組分的分子量，只要測定洗脫液中具有該酶最大活性的部分，然后確定其洗脫體積，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出其分子量。凝膠層析法測定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范圍內(nèi)，線性關(guān)系比較好，但在極端pH時，一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量超過5%時，測得分子量比真實的要大，鐵蛋白則與此相反，測得的分子量比真實的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等會與葡聚糖凝膠形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物與酶-底物絡(luò)合物相似，因此在葡聚糖凝膠上層析時表現(xiàn)異常。用凝膠層析法所測分子量的結(jié)果，要和其它方法的測定相對照，由此才可作出較可靠的結(jié)論。凝膠層析技術(shù)操作方便，設(shè)備簡單，周期短，重復(fù)性能好，而且條件溫和，一般不引起生物活性物質(zhì)的變化，目前已得到相當(dāng)廣泛的應(yīng)用，例如可用于脫鹽，濃縮高分子物質(zhì)的溶液，生化物質(zhì)的分離提純，去除熱源物質(zhì)以及用于測定高分子物質(zhì)的分子量。xa 黑霽住1擁皮騫3.尼龍冋)&樣迴胃晶性c戲往更塵折？ih注掘酒邊煦門z多孔餐童3.莊察.恒丸*進(jìn)n5IB衛(wèi)水岀口氐可河節(jié)的恥子)試劑及器材：試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液(各2—3mg?ml-1，用氯化鉀-乙酸溶液配制)，牛血清清蛋白(Mr67000)，雞卵清蛋白(Mr43000)，胰凝乳蛋白酶原A(Mr25000)和結(jié)晶牛胰島素(pH2時為二聚體Mr12000)等均需層析純。藍(lán)色葡聚糖-2000(8—10mg?ml-i),N-乙酰酪氨酸乙酯(或硫酸銨或重鉻酸鉀)(8—10mg?ml-1)。0.025mo?L-1氯化鉀-0.2mol?L-1乙酸溶液，SephadexG—75(或G—100)，5%Ba(Ac)2。4）待測蛋白質(zhì)樣品液。器材：層析柱：柱管（直徑1.0~1.3cm；管長90~100cm），核酸蛋白檢測儀或紫外分光光度計，自動部分收集器，恒壓瓶，下口瓶。3.操作步驟：A.一般操作方法1^/7-7廂折略映遷接議■啊J里種片賀*2 ? 1tii*J Jr-?■a（1）凝膠的選擇和處理凝膠顆粒最好大小比較均勻，這樣，流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。如果顆粒大小不勻，用傾瀉法傾去不易沉下的較細(xì)顆粒。將稱好的干粉傾入過量的洗脫液（一般多用水，鹽溶液或緩沖溶液）中，室溫下放置，使之充分溶脹。注意不要過分?jǐn)嚩?，以防顆粒破碎。溶脹時間因凝膠交聯(lián)度不同而異為了縮短溶脹時間，可在沸水浴上加熱將近100°C,這樣可大大縮短溶脹時間至幾小時，而且還可以殺死細(xì)菌和霉菌，并可排除凝膠內(nèi)氣泡。種類凝膠溶脹時間請查閱葡聚糖凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù)表。（2）裝柱裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣。裝柱方法與一般柱層析法相似。層析柱可以自制或外購，目前已有各種規(guī)格層析柱商品（圖17-6）。裝柱前須將凝膠上面過多的溶液傾出。關(guān)閉層析柱出水口，并向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約2—3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關(guān)閉出水口。接著再通過2—3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。新裝好的柱要檢驗其均一性，可用帶色的高分子物質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖-2000（又稱藍(lán)色右旋糖，商品名為Bluedextran-2000）、紅色葡聚糖或細(xì)胞色素C等配成2mg/ml的溶液過柱，看色帶是否均勻下降，或?qū)⒅芟蚬庹辗较蛴醚劬τ^察，看是否均勻，有無“紋路”或氣泡。若層析柱床不均一，必須重新裝柱。（3）加樣要照顧到濃度與粘度兩個方面。分析用量：1—2ml/100ml柱床容積（1—2%）；制備用量：20—30ml/100ml柱床容積。加樣方法與一般柱層析相同。夾緊上、下進(jìn)、出水口夾子，為防止操作壓改變，可將塑料管下口抬高至離柱上端約50cm處（SephadexG-75，選用50cm液柱操作壓），打開柱上端的塞子或螺絲帽，吸出層析柱中多余液體直至與膠面相切。沿管壁將樣品溶液小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免將床面凝膠沖起，打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時收集流出液，當(dāng)樣品溶液流至與膠面相切時,夾緊下口夾子。按加樣操作，用1ml洗脫液沖洗管壁2次。最后加入3—4ml洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通恒壓瓶，柱出水口與核酸蛋白質(zhì)檢測儀比色池進(jìn)液口相連，比色池出液口再與自動部分收集器相連（如圖17-7）。4）洗脫洗脫液應(yīng)與凝膠溶脹所用液體相同。洗脫用的液體有水（多用于分離不帶電荷的中性物質(zhì)）及電解質(zhì)溶液（用于分離帶電基團(tuán)的樣品），如酸、堿、鹽的溶液及緩沖液等。對于吸附較強的組分，也有使用水與有機溶劑的混合液，如水-甲醇、水—乙醇、水-丙酮等為洗脫劑，可以減少吸附，將組分洗下。本實驗洗脫用0.025molL-i氯化鉀-0.2mol?L-i乙酸溶液。洗脫時，打開上、下進(jìn)出口夾子，用0.025mol?L-i氯化鉀-0.2molU乙酸溶液，以每管3ml/10min流速洗脫，用自動部分收集器收集流出液。影響洗脫液流速的因素有：洗脫液加在柱上的壓力——操作壓（由液面差引起）。一般來說，流速與柱壓力差成正比，但對某些種類凝膠加壓不能超過一個極限值，否則加大壓力，不僅不能增加流速，反而使流速急劇下降，特別是在使用交聯(lián)度小（WR>7.5）的凝膠時要特別注意。為保持層析過程中恒定的壓力，可使用恒壓瓶。凝膠交聯(lián)度；交聯(lián)度大的凝膠（G-10至G-50型）的流速與柱的壓力差成正比，與柱長成反比，與柱的直徑無關(guān)。交聯(lián)度小的凝膠（G-75至G-200型）的流速與柱的直徑有關(guān)，并在一定操作壓差下有最大的流速值，操作壓見圖17-8。凝膠顆粒大?。侯w粒大時，流速較大，但流速大時洗脫峰形常較寬。顆粒小時，流速較慢，分離情況較好。要求在不影響分離效果情況下，盡可能使流速不致太慢，以免用時過長。（5）重裝一般地說，一次裝柱后，可反復(fù)使用，無特殊的“再生”處理，只須在每次層析后用3—4倍柱床體積的洗脫液過柱。由于使用過程中，顆?？赡苤鸩匠练e壓緊，流速逐漸會減低，使得一次分析用時過多，這時需要將凝膠倒出，重新填裝；或用反沖方法，使凝膠松動沖起，再行沉降。有時流速改變是由于凝膠頂部有雜質(zhì)集聚，則需竟混有臟物的凝膠取出，必要時可將上部凝膠攪松后補充部分新膠，經(jīng)沉集、平衡后即可使用。（6）凝膠的保存方法凝膠用完后，可用以下方法保存。膨脹狀態(tài)：即在水相中保存?？砂醋⒁馐马棧?），加入防腐劑或加熱滅菌后于低溫保存。半收縮狀態(tài)：用完后用水洗凈，然后再用60%—70%乙醇洗，則凝膠體積縮小，于低溫保存。干燥狀態(tài)：用水洗凈后，加入含乙醇的水洗，并逐漸加大含醇量，最后用95%乙醇洗，則凝膠脫水收縮，再用乙醚洗去乙醇，抽濾至干，于60—80°C干燥后保存。這3種方法中，以干燥狀態(tài)保存為最好。B.蛋白質(zhì)分子量測定根據(jù)待測蛋白質(zhì)的分子量范圍選用SephadexG-75或G-100型凝膠，其顆粒在40—120》m,柱管選用直徑1.0—1.3cm，柱長90—100cm，一般選用1.1x100cm商品層析柱。測定Vo和V將0.5ml藍(lán)色葡聚糖-2000和硫酸銨混合液(2mg?ml-1)上柱、洗脫，分別測出Ve。藍(lán)色葡聚糖的Ve即為該柱的V。，硫酸銨洗脫體積Ve減去V。即為柱的?。藍(lán)色葡聚糖的洗脫峰可根據(jù)顏色判斷，硫酸銨洗脫峰用Ba(Ac)2生成沉淀判斷(若用重鉻酸鉀，其洗脫峰，可根據(jù)顏色判斷)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按上述方法將1ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液上柱，然后用0.025mol?L-1氯化鉀-0.2mol?L-1乙酸溶液洗脫。流速3ml/10min，3ml/管。用部分收集器收集，核酸蛋白質(zhì)檢測儀280nm處檢測，記錄洗脫曲線,或收集后用紫外分光光度計280nm處測定每管光吸收值。以管號(或洗脫體積)為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)作出洗脫曲線。根據(jù)洗脫峰位置，量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積(Ve)。然后，以蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)1gMr為縱坐標(biāo)，Ve為橫坐標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖17-9)。為了結(jié)果可靠，應(yīng)以同樣條件重復(fù)1—2次，取Ve的平均值作圖。同時根據(jù)已測出的V。和Vi以及通過測量柱的直徑和凝膠柱床高度，計算出的Vt，分別求出Kd和Kav。也可以Kd或Kav為橫坐標(biāo)，lMr為縱坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品分子量的測定完全按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件操作。4.結(jié)果與討論：根據(jù)紫外檢測的洗脫峰位置，量出洗脫體積，重復(fù)測定1—2次，取其平均值，也可以計算出Kav，分別由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品的分子量。注意事項（1）根據(jù)層析柱的容積和所選用的凝膠溶脹后柱床容積，計算所需凝膠干粉的翌程些翌程些C圖&暹釜崔團(tuán)打洗脫舛訊與分子?GWf）的關(guān)系（2）層析柱粗細(xì)必須均勻，柱管大小可根據(jù)實際需要選擇。一般來說，細(xì)長的柱分離效果較好。若樣品量多，最好選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時，會發(fā)生“管壁效應(yīng)”，即柱管中心部分的組分移動慢，而管壁周圍的移動快。柱越長，分離效果越好，但柱過長，實驗時間長，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。用于脫鹽的柱一般都是短而粗，柱長（L）/直徑（D）V10；對分級分離用的柱,L/D值可以比較大，對很難分離的組分可以達(dá)到L/D=100,—般選用內(nèi)徑為1cm,柱長100cm就夠了。（3）各接頭不能漏氣，連續(xù)用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內(nèi)的排氣管應(yīng)無液體，并隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產(chǎn)生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過程中，層析柱內(nèi)液面不斷下降，則表示整個系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細(xì)檢查并加以糾正。（4）裝柱要均勻，不過松也不過緊，最好也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此而壓緊凝膠。但也不宜過慢，使柱裝得太松，導(dǎo)致層析過程中，凝膠床高度下降。（5）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動，導(dǎo)致分離效果變壞，不得不重新裝柱。（6）樣品溶液的濃度和粘度要合適。濃度大，自然粘度增加。一個粘度很大的樣品上柱后，樣品分子因運動受限制，影響進(jìn)出凝膠孔隙，洗脫峰形顯得寬而矮，有些可分離的組分也因此重疊。（7）洗脫用的液體應(yīng)與凝膠溶脹所用液體相同，否則，由于更換溶劑引起凝膠容積變化，從而影響分離效果。（8）操作壓過大可使流速變慢，此外還可以導(dǎo)致凝膠膠面下降，柱床容積的改變，相應(yīng)測出vv。，v等也改變，造成實驗結(jié)果的誤差。（9）由于葡聚糖凝膠為糖類化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止發(fā)霉與生長細(xì)菌。一般可用0.02%的疊氮鈉（NaN3）溶液，它極易溶于水，不與蛋白質(zhì)和糖反應(yīng)，也不改變它們的層析效果，也可用0.002%的洗必泰（hibitane）溶液。在弱酸性溶液中，可用0.05%（或0.01%—0.02%）三氯丁醇溶液，但它在強堿性溶液或加熱到60°C以上時就要分解。在弱堿性溶液中也可用0.01%乙酸汞溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等為防腐劑。因為它們能引起凝膠顆粒的收縮，同時還能進(jìn)入層析儀器的塑料部件，使塑料變軟，造成不良后果。（10）使用部分收集器時，將其轉(zhuǎn)盤調(diào)節(jié)到最外圈，從第一管開始，否則會造成轉(zhuǎn)換臂的轉(zhuǎn)動與轉(zhuǎn)盤不同心，以致洗脫液流到管外。凝膠層析中常遇到的故障之原因與排除方法總結(jié)見下表。故障產(chǎn)生的原因排出的方法恒壓瓶不能恒壓1.恒壓瓶上口或下口橡膠塞未塞緊或橡1?找出漏氣原因，塞緊橡膠塞

膠塞插玻璃管處漏氣層析柱連接后，進(jìn)水口無液體滴出2.層析柱進(jìn)水口或出水口的止水夾未打開3?進(jìn)水口塑料管中有氣泡2?打開止水夾3?排除塑料管中的氣泡層析柱出水口無液體流出4?出水口的止水夾未打開5.層析柱下口螺絲未旋緊，因漏氣而造成出水塑料管中有氣泡6?出水口塑料管被凝膠阻塞4?打開出水口止水夾并調(diào)節(jié)流速5?找出產(chǎn)生氣泡的原因，排除氣泡6?將層析柱中的凝膠倒出，沖洗尼龍網(wǎng)排除塑料管中的凝膠，重新裝柱層析過程中流速逐漸減慢7.樣品中或洗脫緩沖液中含有不溶顆粒將膠床表面阻塞8?操作壓過高，將凝膠膠床壓緊9.測定內(nèi)水時硫酸銨濃度太大；凝膠脫水使膠床壓緊.加樣時未注意恒壓，加樣后膠床床面下降?長期使用，微生物生長?裝柱時凝膠未完全溶脹，平衡時流速即逐漸減慢?凝膠顆粒過細(xì)，或由于用暴力攪動凝膠使凝膠顆粒打碎7?采用離心或過濾法除去不溶顆粒，用滴管移去柱床表面1—2cm的凝膠，補加新凝膠至同樣高度8?重新裝柱，采用適當(dāng)?shù)牟僮鲏??將凝膠取出用緩沖液反復(fù)洗滌，溶脹重新裝柱。適當(dāng)降低硫酸銨濃度?加樣時應(yīng)根據(jù)操作壓，將塑料管下水口抬高至相應(yīng)的操作壓?層析柱不用時，在平衡緩沖液中加入0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰，并使其充滿柱床體積，以抑制細(xì)菌生長，暫時不用的柱應(yīng)定期用緩沖液過柱沖洗，也可以防止微生物生長?將凝膠取出，待其完全溶脹后重新裝柱?取出層析柱中的凝膠，用漂浮法除去過細(xì)的顆粒，重新裝柱，攪拌凝膠應(yīng)防止暴力層析柱膠床中有氣泡?裝柱前，凝膠未抽氣或煮沸，在凝膠中混入空氣?加樣不當(dāng)使空氣進(jìn)入凝膠膠床16?從冰箱中取出凝膠或凝膠緩沖液立即裝柱，或裝柱后被太陽暴曬?在凝膠柱上層的氣泡可用細(xì)頭長滴管或細(xì)塑料管將氣泡取出或趕走，并重新平衡，穩(wěn)定膠床后再使用，若氣泡太多則應(yīng)抽氣或煮沸后自然冷卻后裝柱.小心加樣防止帶進(jìn)氣泡16?凝膠或緩沖液應(yīng)放置到室溫后才能裝柱，避免太陽直射層析柱膠床破裂17?大量空氣進(jìn)入層析柱18?進(jìn)水口流速慢，出水口流速快17?找出空氣進(jìn)入層析柱的原因，重新裝柱18?找出進(jìn)出水口流速不一致的原因，重新裝柱

樣品進(jìn)入凝膠后條帶扭曲?樣品或緩沖液中有顆粒或不溶物?凝膠表面不平，或膠床不均勻?按方法7處理樣品或緩沖液?將凝膠柱置于垂直位，輕輕攪動膠床表面1—2cm處的凝膠，使其自然沉降凝膠層析分辨率不高21?凝膠層析柱裝得不均勻21?將凝膠取出重新裝柱22?凝膠G型選擇不當(dāng)22?根據(jù)欲分離物質(zhì)分離的情況，選擇合適的凝膠G型與粒度23?加樣量太大23.為提高分辨率，分析時加樣量一般為柱長24?柱床太短的1—2%，最多不能超過5%25?樣品濃度高，粘度大而形成拖尾24?將柱床高度適當(dāng)加長26?洗脫時流速太快25?根據(jù)紫外測定的光吸收值將樣品適當(dāng)稀釋27?分部收集時每管體積過大26?調(diào)節(jié)洗脫的流速，（本實驗為3ml/10min）27?控制每管收集量，為便于紫外測定，每管收集量以2.8—3ml為宜分部收集時,收集盤28?使用前未經(jīng)定位或開始收集后隨便28?將自動收集器換向開關(guān)撥向“順”，連續(xù)按轉(zhuǎn)動一次間隔數(shù)只移動轉(zhuǎn)換臂，從而造成收集盤與轉(zhuǎn)換臂手動開關(guān)，使收集盤與轉(zhuǎn)換臂同時以“順”時針試管或滴管口偏離轉(zhuǎn)動不同步方向轉(zhuǎn)至外圈零位。將換向開關(guān)撥至“逆”，使相應(yīng)的試管轉(zhuǎn)換臂的滴管口對準(zhǔn)第一個試管中心，打開自動開關(guān)即可進(jìn)行同步收集三、SDS■聚丙烯酰胺凝膠電泳法1.原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）是對蛋白質(zhì)進(jìn)行量化，比較及特性鑒定的一種經(jīng)濟、快速、而且可重復(fù)的方法。該法主要依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量對其進(jìn)行分離。SDS與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，并使其穩(wěn)定地存在于一個廣泛均一的溶液中。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的長度與其分子量成正比。由于在樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。SDS-PAGE因易于操作和廣泛的用途，使它成為許多研究領(lǐng)域中一種重要的分析技術(shù)。SDS是十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate）的簡稱，它是一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。這樣就使電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，于是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)和遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得未知物的分子量。2■材料器材微型凝膠電泳裝置；電源（電壓200V，電流500mA）；100°C沸水??；Eppendorf管；微量注射器（50》l或100》1）；干膠器、真空泵或水泵；帶蓋的玻璃或塑料小容器；搖床。試劑⑴2mol/LTris-HCl（pH8.8）:取24.2gTris，加50ml蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸至pH8.8（約加4ml）；讓溶液冷卻至室溫，pH將會升高，加蒸餾水至100ml。⑵1mol/LTris-HCl（pH8.8）:取12.1gTris，加50ml蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸至pH6.8（約加8ml）；讓溶液冷卻至室溫，pH將會升高，加蒸餾水至100ml。

⑶10%(w/v)SDS:取10g的SDS,加蒸餾水至100ml。50%(v/v)甘油:取50ml100%甘油，加入50ml蒸餾水。1%(w/v)溴酚藍(lán)：取100mg溴酚藍(lán)，加蒸餾水至10ml,攪拌，直到完全溶解，過濾除去聚合的染料。A液 丙烯酰胺儲備液(配制含30%(w/v)丙烯酰胺和0.8%(w/v)甲叉雙丙烯酰胺的溶液100ml)在通風(fēng)柜中操作，取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加蒸餾水至100ml，緩慢攪拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蠟?zāi)し饪?，可?°C存放數(shù)月。⑺B液——x分離膠緩沖液：取75ml2mol/LTris-HCl(pH8.8)，加入4ml10%SDS，加21ml蒸餾水，混勻，可在4°C存放數(shù)月。⑻C液——x濃縮膠緩沖液：取50ml1mol/LTris-HCl(pH6.8)，加入4ml10%SDS，加46ml蒸餾水，混勻，可在4°C存放數(shù)月。⑼10%過硫酸銨：取0.5g過硫酸銨，加入5ml蒸餾水，可保存在密圭寸的管內(nèi)，于4°C存放數(shù)月。⑽電泳緩沖液：取3gTris，14.4g甘氨酸，1gSDS，加蒸餾水至1L，pH約為8.3，也可配制成10x的儲備液，在室溫下長期保存。5x樣品緩沖液：取0.6ml1mol/LTris-HCl(pH6.8)，加入2ml10%SDS，5ml50%的甘油，0.5ml2-巰基乙醇，1ml1%溴酚藍(lán)，0.9ml的蒸餾水混勻，可在4°C保存數(shù)周，或在-20°C保存數(shù)月?？捡R斯亮藍(lán)染液：1.0g考馬斯亮藍(lán)R-250，加入450ml甲醇，450ml蒸餾水及100ml冰醋酸即成。的考馬斯亮藍(lán)脫色液：將100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸餾水混勻備用。3.操作A.灌制分離膠⑴組裝凝膠模具：可按照使用說明書裝配好灌膠用的模具。對于Bio-Rad的微型凝膠電泳系統(tǒng)，在上緊螺絲之前，必須確保凝膠玻璃板和隔片的底部與一個平滑的表面緊密接觸，有細(xì)微的不匹配就會導(dǎo)致凝膠的滲漏。

（2）將A液、B液及蒸餾水在一個小燒瓶或試管中混合，丙烯酰胺（A液中）是神經(jīng)毒素，操作時必須戴手套。加入過硫酸銨和TEMED后，輕輕攪拌使其混勻（過量氣泡的產(chǎn)生會干擾聚合）。凝膠很快會聚合，操作要迅速。小心將凝膠溶液用吸管沿隔片緩慢加入模具內(nèi)，這樣可以避免在凝膠內(nèi)產(chǎn)生氣泡。⑶當(dāng)加入適量的分離膠溶液時（對于小凝膠，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5cm或距梳子齒約0.5cm），輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層1mm?5mm的水層，這使凝膠表面變得平整。當(dāng)凝膠聚合后，在分離膠和水層之間將會出現(xiàn)一個清晰的界面。灌制濃縮膠⑴吸盡覆蓋在分離膠上的水后將A液、C液和蒸餾水在三角燒瓶或小試管中混合。加入過硫酸銨和TEMED，并輕輕攪拌使其混勻。⑵將濃縮膠溶液用吸管加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端。將梳子插入凝膠內(nèi)，直至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊。必須確保梳子齒的末端沒有氣泡。將梳子稍微傾斜插入可以減少氣泡的產(chǎn)生。⑶凝膠聚合后，小心拔出梳子，不要將加樣孔撕裂。將凝膠放入電泳槽內(nèi)，如果使用Bio-Rad的微型凝膠系統(tǒng)，可預(yù)先接好電極。將電泳緩沖液加入內(nèi)外電泳槽中，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。制備樣品和上樣⑴將蛋白質(zhì)樣品與5x樣品緩沖液（20“1+5"在一個Eppendorf管中混合。100r加熱2min?10min。離心1s，如果有大量蛋白質(zhì)碎片則應(yīng)延長離心時間。⑵用微量注射器將樣品加入樣品孔中。將蛋白質(zhì)樣品加至樣品孔的底部，并隨著染料水平的升高而升高注射器針頭。避免帶入氣泡，氣泡易使樣品混入到相鄰的加樣孔中。電泳⑴將電極插頭與適當(dāng)?shù)碾姌O相接。電流流向陽極。將電壓調(diào)至200V（保持恒壓；對于兩塊0.75mm的膠來說，電流開始時為100mA，在電泳結(jié)束時應(yīng)為60mA；對于兩塊1.5mm的膠來說，開始時應(yīng)為110mA,結(jié)束時應(yīng)為80mA）。（2）對于兩塊0.75mm的凝膠，染料的前沿遷移至凝膠的底部約需30?40分鐘（1.5mm的凝膠則需40min?50min）。關(guān)閉電源從電極上拔掉電極插頭，

取出凝膠玻璃板，小心移動兩玻璃板之間的隔片，將其插入兩塊玻璃板的一角。輕輕撬開玻璃板，凝膠便會貼在其中的一塊板上?？捡R斯亮藍(lán)染色這種染色方法在單條電泳帶中蛋白質(zhì)最小檢出量為o.iug的蛋白。通?？梢愿鶕?jù)所需要的敏感度來選擇是使用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染色。⑴戴上手套避免將手指印留在電泳凝膠上，將凝膠移入一個小的盛有少量考馬斯亮藍(lán)（20ml已經(jīng)足夠）的容器內(nèi)（小心不要將膠撕破）?；?qū)⒉ＡО暹B同凝膠浸在染料中輕輕振蕩直至凝膠脫落。⑵對于0.75mm的凝膠，可在搖床上緩慢震蕩5分鐘?10分鐘，對于1.5mm的凝膠，則需10分鐘?20分鐘，在染色和脫色過程中要用蓋子或封口膜密閉容器口。棄去染液，將凝膠在水中漂洗數(shù)次。戴手套以避免將雙手染色。⑶加入考馬斯亮藍(lán)脫色液（約50ml），清晰的條帶很快會顯現(xiàn)出來，大部分凝膠脫色需要1h,使用過的脫色液則可用水沖洗掉。為了脫色完全，需數(shù)次更換脫色液并震蕩過夜。干膠⑴用一張10cmx12cm的Whatman3MM濾紙覆蓋凝膠，用一張玻璃紙或塑料保鮮膜覆蓋在凝膠的另一個表面，小心不要將氣泡裹進(jìn)去，這樣會導(dǎo)致凝膠的破裂?？捎靡粋€試管作為卷軸推趕，可以有效的除去氣泡。⑵將濾紙置于干膠器上，開啟加熱和抽真空開關(guān)，并蓋上帶有密封圈的蓋子。待凝膠烘干后小心取出即可。4.結(jié)果根據(jù)凝膠中標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的相對遷移率判斷待測樣品的大致分子量。根據(jù)蛋白質(zhì)分子量對數(shù)和電泳遷移率的關(guān)系，精確測量溴酚藍(lán)和各種蛋白質(zhì)遷移距離。把溴酚藍(lán)遷移的距離定為d［，蛋白質(zhì)遷移距離定為d2，并以D1定為凝膠染色前的長度，D2定為凝膠染色后的長度。根據(jù)下面公式計算各種蛋白質(zhì)的遷移率Rm：Rm=d2d1xD1D2以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率為橫座標(biāo)，以其對應(yīng)的分子量對數(shù)為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到一條直線，然后根據(jù)未知樣品的遷移率，在半對數(shù)座標(biāo)圖上查出其對應(yīng)的分子量。要得到一個可靠的結(jié)果，實驗需多次重復(fù)。

四、凝膠滲透色譜(GPC)法分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。聚合物的性能與其分子量和分子量分布密切相關(guān)。體積排除色譜(sizeexclusionchromatography,SEC)是液相色譜的一個分支，已成為測定聚合物分子量分布和結(jié)構(gòu)的最有效手段。其還可測定聚合物的支化度,共聚物及共混物的組成。采用制備型的色譜儀,可將聚合物按分子量的大小分級,制備窄分布試樣,供進(jìn)一步分析和測定其結(jié)構(gòu)。該方法的優(yōu)點是：快捷、簡便、重視性好、進(jìn)樣量少、自動化程度高。體積排除色譜在一段時期內(nèi)常稱為凝膠滲透色譜(gelpermeationchromatography,GPC)、凝膠過濾色譜(gelfiltrationchromatography,GFC)、凝膠色譜。從分離機理看,使用體積排除色譜較為確切。1.基本原理：體積排除色譜(SEC)分離機理認(rèn)為在多孔載體(其孔徑大小有一定的分布，并與待分離的聚合物分子尺寸可比擬的凝膠或多孔微球)充填的色譜柱里引入聚合物溶液,用溶劑淋洗,體系是處于擴散平衡的狀態(tài)。聚合物分子在柱內(nèi)流動過程中,不同大小的分子向載體孔洞滲透的程度不同,大分子能滲透進(jìn)去的孔洞數(shù)目比小分子少,有些孔洞即使大小分子都能滲透進(jìn)去,但大分子能滲透的深度淺。溶質(zhì)分子的體積越小滲透進(jìn)去的幾率越大,隨著溶劑流動,它在柱中保留的時間越長。如果分子的尺寸超過載體孔的尺寸時,則完全不能滲透進(jìn)孔里,只能隨著溶劑從載體的粒間空隙中流過,最先淋出。當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時,較小的分子在柱中保留的時間比大分子保留的時間要長,于是整個樣品即按分子尺寸由大到小的順序依次流出。色譜柱總體積為Vt，載體骨架體積為vg,載體中孔洞總體積為V，載體粒tgi間體積為v0,貝UVtFg+V0+ViV0和Vi之和構(gòu)成柱內(nèi)的空間。溶劑分子體積遠(yuǎn)小于孔的尺寸，在柱內(nèi)的整個空間(V0+Vi)活動；高分子的體積若比孔的尺寸大，載體中任何孔均不能進(jìn)入，只能在載體粒間流過，其淋出體積是V。；高分子的體積若足夠小，如同溶劑分子尺寸，所有的載體孔均可以進(jìn)出，其淋出體積為(V0+Vi)；高分子的體積是

中等大小的尺寸，它只能在載體孔Vj的一部分孔中進(jìn)出，其淋出體積ve為ieV=V0+KV.e0iK為分配系數(shù)，其數(shù)值0WKW1,與聚合物分子尺寸大小和在填料孔內(nèi)、外的濃度比有關(guān)。當(dāng)聚合物分子完全排除=0;在完全滲透時，K=度比有關(guān)。當(dāng)聚合物分子完全排除=0;在完全滲透時，K=1（見圖當(dāng)K=0時，Ve=V0；；此處所對應(yīng)合物分子量是該色譜柱的滲透極限（PL）,商品SEC儀器的PL常用乙烯的分子量表示。聚合物分子量PL值時，只能在V0以前被淋洗出有分離效果。V0和vg對分離作用沒有貢獻(xiàn),時，K4-1）。的聚

聚苯超過來，沒保留體積（K）也6-1SZ打卜劉迫山 應(yīng)設(shè)法減小；V.是分離的基礎(chǔ)，其值越大柱子分離效果越好。制備孔容大，能承受壓力，粒度小，又分布均勻，外形規(guī)則（球形）的多孔載體，讓其盡可能緊密裝填以提高分離能力。柱效的高低，常采用理論塔板數(shù)N和分離度R來作定性的描述。測定N的方法可以用小分子物質(zhì)作出色譜圖1從圖上求得流出體積Ve和峰e寬W,以下式計算N值：N=（4V/W）2,N值越大，意味著柱子的效率越高。e“1”、“2”代表分子量不同的兩種標(biāo)準(zhǔn)樣品，Ve,］、Ve,2、W1，W2為其淋出體積和峰寬，分離度R的計算為R=2V,2—Ve丿，若