質(zhì)粒提取原理及堿法

質(zhì)粒提取原理質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)的一種環(huán)狀的小分子DNA，是進(jìn)行DNA重組的常用載體。作為一個(gè)具有自身復(fù)制起點(diǎn)的復(fù)制單位獨(dú)立于細(xì)胞的主染色體之外，質(zhì)粒DNA上攜帶了部分的基因信息，經(jīng)過(guò)基因表達(dá)后使其宿主細(xì)胞表現(xiàn)相應(yīng)的性狀。在DNA重組中，質(zhì)?；蚪?jīng)過(guò)改造后的質(zhì)粒載體可通過(guò)連接外源基因構(gòu)成重組體。從宿主細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，是DNA重組技術(shù)中最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技能。分離質(zhì)粒DNA有三個(gè)步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增，收集和裂解細(xì)菌，分離和純化質(zhì)粒DNA。在質(zhì)粒提取過(guò)程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等的原因，可能使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂。所以，多數(shù)質(zhì)粒粗提取物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）:質(zhì)粒的兩條鏈沒(méi)有斷裂；超螺旋開(kāi)環(huán)DNA（ocDNA）：質(zhì)粒的一條鏈斷裂；松弛的環(huán)狀分子線(xiàn)形DNA（1DNA）：質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；線(xiàn)性分子質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型。質(zhì)粒DNA瓊脂塘凝膠電泳模式圖可分為:松弛線(xiàn)性的DNA；松弛開(kāi)環(huán)的OC構(gòu)型；超螺旋的SC構(gòu)型。由于瓊脂糖中加有嵌入型染料漠化乙錠，因此，在紫外線(xiàn)照射下DNA電泳帶成橘黃色。道中的SCDNA走在最前沿，OCDNA則位于凝膠的最后邊；道中的LDNA是經(jīng)核酸內(nèi)切限制酶切割質(zhì)粒之后產(chǎn)生的，它在凝膠中的位置介于OCDNA和SCDNA之間。質(zhì)粒小量提取之堿裂解法試驗(yàn)原理：堿裂解法是較常用的提取的方法。其優(yōu)點(diǎn)是收獲率高，適于多數(shù)的菌株，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后可滿(mǎn)足多數(shù)的DNA重組操作。十二烷基磺進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。用SDS處理細(xì)菌后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂，釋放出質(zhì)粒DNA和染色體DNA，兩種DNA在強(qiáng)堿環(huán)境都會(huì)變性。由于質(zhì)粒和主染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同，變性時(shí)前者雖然兩條鏈分離，卻仍然纏繞在一起不分開(kāi)；但后者完全變性分甚至出現(xiàn)斷裂，因此，當(dāng)加入PH4.8的酸性乙酸鉀降低溶液pH值，使溶液pH值恢復(fù)較低的近中性水平時(shí)，質(zhì)粒的兩條小分子單鏈可迅速?gòu)?fù)性恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)，但是主染色體DNA則難以復(fù)性。在離心時(shí)，大部分主染色體與細(xì)胞碎片，雜質(zhì)等纏繞一起被沉淀，而可溶性的質(zhì)粒DNA留在上清夜中。再由異丙醇沉淀、乙醇洗滌，可得到純化的質(zhì)粒DNA。堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析等。試驗(yàn)準(zhǔn)備：1、 溶液I:pH8.0GET緩沖液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA,25mmol/LTris—HCl）；溶液I可成批配制，在10lbf/in2（6.895x104Pa）高壓下蒸氣滅菌15min,貯存于4P。葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)很快沉積到管子的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，在溶液I中加入EDTA，是要把大腸桿菌細(xì)胞中的二價(jià)金屬離子都螯合掉。從而起到抑制DNase對(duì)DNA的降解和抑制微生物生長(zhǎng)的作用。2、溶液II：0.2mol/LNaOH（內(nèi)含1%的SDS），這個(gè)用的時(shí)候需現(xiàn)配。要新配置溶液II是為了避免NaOH接觸空氣中的CO2而減弱了堿性。NaOH是最佳溶解細(xì)胞的試劑。不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)在瞬間溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化。用不新鮮的0.4NNaOH，即便有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌。SDS是離子型表面活性劑。它主要作用是：a溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，從而破壞細(xì)胞膜。b解聚細(xì)胞中的核蛋白。c能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…日+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下來(lái)的提取過(guò)程必須把它去除干凈，以便下一步試驗(yàn)的更好進(jìn)行。3、溶液III：pH4.8乙酸鉀溶液（60ml5mol/LKAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；該溶液鉀離子濃度為3mol/L，醋酸根離子濃度為5mol/L.pH4.8的乙酸鉀溶液是為了把抽提液的pH調(diào)至中性，從而使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性，且穩(wěn)定存在。溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是K+置換了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)辂}與SDS一蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鹽形式復(fù)合物。4、異丙醇；采用PEG(6000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1%左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20%。5、 無(wú)水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，同時(shí)乙醇與核酸不起化學(xué)反應(yīng)，因此是理想的沉淀劑。加入的乙醇后，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿?，DNA失水聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67%左右。也可改用95%乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇。但是加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95%乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15—30min即可。但因?yàn)槭褂卯惐紩r(shí)常把鹽沉淀下來(lái)，所以較多的還是使用乙醇。6、pH8.0TE緩沖液；10mmol/LTris—HCl，1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20ug/ml。在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa=7.2)和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類(lèi)及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類(lèi)及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過(guò)程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下(pH5?7）,RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。7、70%乙醇試驗(yàn)步驟：1、無(wú)菌操作臺(tái)上，取1.5ml培養(yǎng)菌體置于離心管（Eppendorf管）中，微量離心機(jī)上以10000rpm離心1min，或者以4000rpm離心5—10min,棄上清液，離心管倒扣于干凈的吸水紙上吸干。2、 沉淀中加100pl用冰預(yù)冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要?jiǎng)×艺袷帲Ｊ覝叵路胖?0min。3、 加入200pl溶液II（新鮮配置），加蓋后輕輕快速顛倒離心管數(shù)次混勻（千萬(wàn)不要振蕩），冰浴5min。4、加入150pl預(yù)冷溶液III，輕輕顛倒數(shù)次混勻（10s），置于冰浴15min。5、微量離心機(jī)上以4°C，12000rpm離心15min，取上清液于另一新Eppendorf管中。6、上清夜中加入等體積酚/氯仿（1：1）混勻，微量離心機(jī)上以4C，12000rpm,離心5min。｛經(jīng)驗(yàn)之談：如果選用宿主合適的話(huà)（如DH5a、XL1-blue等，HB101和BL21則不行），可以不用酚氯仿抽提這一步。用1倍體積的乙醇沉淀，沉淀中所含的鹽和RNA就很少了，完全去除上清液后就可以直接加TE溶解質(zhì)粒，后續(xù)的限制性酶切、轉(zhuǎn)化完全沒(méi)有問(wèn)題。僅供參考｝7、小心轉(zhuǎn)上層至一新的離心管棄去中層的蛋白質(zhì)和下層的有機(jī)相。8、小心移出上清于一新Eppendorf管中，加入2/3倍體積異丙醇，混勻，4°。離心

12000gX5min。9、上清夜中加入2倍體積的無(wú)水乙醇混勻，室溫下放置5min—10min，以12000rpm，離心5min-15min。10、1.0ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1?2次,沉淀在室溫下晾干。11、小心吸去上清夜，將離心管倒置于一張紙上，使所有的液體流出。再將附著在管壁上的液滴除去。在除去管壁上的液滴時(shí)，可以用一次性吸頭與真空管相連，用吸頭接觸液面。但在液體吸出時(shí)應(yīng)當(dāng)盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀。自然干燥或者真空抽干到看不到液滴最好。12、加入50p1TE緩沖液(PH8.0含20pg/mlRNaseA)溶解質(zhì)粒粗提物，在-20°C保存。注意事項(xiàng)：提取過(guò)程應(yīng)盡量在低溫環(huán)境中進(jìn)行，蛋白質(zhì)的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提盡量將蛋白質(zhì)除