醫(yī)學(xué)微生物學(xué)：第7章 細(xì)菌感染的檢測方法與防治原則

細(xì)菌感染的檢測方法與

防治原則1本章重點(diǎn)與難點(diǎn)細(xì)菌感染性標(biāo)本的采集原則細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)程序常用的血清學(xué)診斷方法適應(yīng)性免疫的獲得方式人工免疫的概念和常用的免疫制劑細(xì)菌感染的治療原則2第一節(jié)細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)診斷3形態(tài)學(xué)檢查可疑細(xì)菌感染血清（雙份）標(biāo)本含菌標(biāo)本直接凝集試驗(yàn)乳膠凝集試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)ELISA等細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定細(xì)菌成分檢測凝集試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)酶免疫技術(shù)、免疫印跡試驗(yàn)等細(xì)菌培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)檢查生物試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定動物試驗(yàn)、藥物敏感試驗(yàn)核酸雜交、PCR16SrRNA基因序列分析基因芯片等核酸檢測抗原檢測特異性抗體檢測細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法4一.臨床標(biāo)本的采集與運(yùn)送原則早期采集無菌操作選感染部位最佳時(shí)間采集雙份血清標(biāo)本采集做好標(biāo)記置于密閉容器內(nèi)盡快送檢標(biāo)本運(yùn)送5二、細(xì)菌的檢測6（一）細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查暗視野顯微鏡相差顯微鏡主要用于檢查在生活狀態(tài)下細(xì)菌的動力及其運(yùn)動情況不染色標(biāo)本7細(xì)菌的染色革蘭染色抗酸染色熒光金胺O染色其他特殊染色89革蘭染色葡萄球菌（革蘭染色陽性）大腸埃希菌（革蘭染色陰性）9細(xì)菌檢查的一般程序標(biāo)本膿/痰/尿血、腦脊液等涂片、染色、鏡檢分離培養(yǎng)純培養(yǎng)生化反應(yīng)血清學(xué)鑒定藥敏試驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)增菌(二)細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定10細(xì)菌的分離培養(yǎng)培養(yǎng)基的成分pH培養(yǎng)時(shí)間溫度氣體環(huán)境在血平板上的肺炎鏈球菌菌落11生化試驗(yàn)?zāi)c道感染細(xì)菌在含鐵雙糖培養(yǎng)基上的生化反應(yīng)12血清學(xué)鑒定利用已知的特異性抗體檢查未知的純培養(yǎng)細(xì)菌對細(xì)菌進(jìn)行種、群、型的鑒定沙門菌血清學(xué)鑒定摘自《臨床微生物檢驗(yàn)》（第五版）人民衛(wèi)生出版社13藥物敏感試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法、稀釋法、E-test法……最低抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration,MIC）能夠完全抑制培養(yǎng)基中細(xì)菌生長的最低藥物濃度最低殺菌濃度（minimumbactericidalconcentration,MBC）能夠殺死培養(yǎng)基中細(xì)菌的最低藥物濃度14紙片擴(kuò)散法含有定量抗生素的紙片貼在已接種待檢病原菌的瓊脂平板上，紙片上的抗生素向周圍瓊脂中擴(kuò)散，形成了逐漸減小的藥物濃度梯度。由于致病菌對各種抗生素的敏感程度不同，在藥物紙片周圍便出現(xiàn)抑制病原菌生長而形成的大小不同的抑菌環(huán)。根據(jù)抑菌環(huán)的有無和大小來判定試驗(yàn)菌對該抗菌藥物耐藥或敏感。15稀釋法以一定濃度的抗菌藥物與含有待檢細(xì)菌的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），經(jīng)培養(yǎng)后觀察其最低抑菌濃度。稀釋法瓊脂稀釋法——使用瓊脂培養(yǎng)基肉湯稀釋法——使用肉湯培養(yǎng)基16抗生素連續(xù)梯度法（E-test法）將稀釋法和擴(kuò)散法的原理相結(jié)合，使用預(yù)先設(shè)定的穩(wěn)定且連續(xù)的抗菌藥物濃度梯度，采用瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)以確定不同抗菌藥物對微生物的最低抑菌濃度（MIC）。17將培養(yǎng)基上分離的可疑致病菌配制成純菌液，放入自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)中，通過計(jì)算機(jī)自動掃描、讀數(shù)、分析、最后報(bào)告鑒定及藥敏結(jié)果。摘自《臨床微生物檢驗(yàn)》（第五版）人民衛(wèi)生出版社18自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)藥敏檢測原理微型化的肉湯稀釋試驗(yàn)根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)得到相應(yīng)敏感度：敏感、中度敏感和耐藥微生物數(shù)碼鑒定原理計(jì)算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個(gè)細(xì)菌條目對系統(tǒng)中每個(gè)生化反應(yīng)出現(xiàn)的頻率總和性能特點(diǎn)自動化程度較高、檢測速度快、可鑒定細(xì)菌種類及藥敏試驗(yàn)種類多、數(shù)據(jù)處理軟件功能強(qiáng)大、結(jié)果準(zhǔn)確可靠系統(tǒng)組成測試卡（板）、菌液接種器、培養(yǎng)和監(jiān)測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)19（三）細(xì)菌抗原的檢測凝集試驗(yàn)用已知抗體檢測待檢標(biāo)本中未知的顆粒性抗原。IgG的Fc段與金葡菌的SPA結(jié)合，F(xiàn)ab段與細(xì)菌抗原結(jié)合后，可使金葡菌發(fā)生肉眼可見的凝集現(xiàn)象。協(xié)同凝集試驗(yàn)用已知的熒光抗體檢測待檢標(biāo)本中的未知抗原，借助熒光顯微鏡觀察。免疫熒光技術(shù)對流免疫電泳利用雙向瓊脂擴(kuò)散與電泳技術(shù)相結(jié)合的方法。由于電泳和電滲作用，抗原向正極移動，抗體向負(fù)極移動，在比例合適處形成肉眼可見的沉淀線。用酶標(biāo)記的抗體檢測特異性可溶性抗原的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。酶免疫技術(shù)20PCR（含RT-PCR、realtimePCR等）核酸雜交技術(shù)基因芯片技術(shù)16SrRNA基因序列分析（四）細(xì)菌核酸的檢測21（五）生物芯片技術(shù)將核酸片段、蛋白質(zhì)或酶、抗原或抗體、細(xì)胞及組織等生物樣品有序地固定于硅片、尼龍膜等固相支持物上，在一定的條件下進(jìn)行生化反應(yīng)。用化學(xué)熒光法、酶標(biāo)法或同位素法顯示反應(yīng)結(jié)果，通過特定的儀器讀取與收集數(shù)據(jù)，并用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而判斷樣品中靶分子的種類和數(shù)量。22生物芯片的分類基因芯片（genechips），又稱DNA芯片蛋白質(zhì)芯片細(xì)胞芯片組織芯片糖芯片23生物芯片的用途微生物感染的快速診斷：對某些病原體，如細(xì)菌、真菌和病毒進(jìn)行多重快速檢查與鑒別；微生物變異機(jī)制和耐藥機(jī)制的研究；微生物基因分型及分子流行病學(xué)的調(diào)查；微生物基因組及后基因組的研究：可研究病原體基因的序列、轉(zhuǎn)錄表達(dá)、抗原的表達(dá)及細(xì)菌糖鍵的特異性研究；抗微生物感染藥物的研制等。24三、細(xì)菌感染的血清學(xué)診斷用已知的細(xì)菌或其特異性抗原檢測病人血清或其他體液中的抗體及其效價(jià)的變化，可以作為感染性疾病的輔助診斷。由于本實(shí)驗(yàn)多采取病人血清檢測抗體，故常稱為血清學(xué)診斷（serologicaldiagnosis）。一般適用于抗原性較強(qiáng)的細(xì)菌，以及病程較長的感染性疾病。也可用于調(diào)查人群對某病原菌的免疫應(yīng)答水平以及檢測疫苗接種后的預(yù)防效果。25細(xì)菌性感染的血清學(xué)診斷血清學(xué)試驗(yàn)疾病舉例直接凝集反應(yīng)肥達(dá)試驗(yàn)、外斐試驗(yàn)乳膠凝集試驗(yàn)?zāi)X膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌沉淀試驗(yàn)梅毒間接免疫熒光技術(shù)各類微生物感染補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)Q熱中和試驗(yàn)風(fēng)濕熱（抗O試驗(yàn)）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)各類微生物感染26第二節(jié)細(xì)菌感染的特異性預(yù)防27機(jī)體獲得特異性免疫力的方式自然免疫人工免疫主動免疫：疫苗或類毒素等被動免疫：抗毒素或丙種球蛋白等主動免疫：隱性或顯性感染被動免疫：獲得母體的Ab(胎盤/初乳)2829一、人工主動免疫人工主動免疫（artificialactiveimmunization）是將疫苗或類毒素接種于人體，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，機(jī)體主動產(chǎn)生獲得性免疫力的一種防治微生物感染的措施，主要用于特異性預(yù)防。采用人工主動免疫方法通常稱為預(yù)防接種（prophylacticinoculation）或疫苗接種（vaccination）。特異性預(yù)防疫苗類毒素29疫苗的種類死疫苗：傷寒疫苗、霍亂疫苗活疫苗（減毒活疫苗）：卡介苗（BCG）亞單位疫苗：肺炎鏈球菌莢膜多糖基因工程疫苗載體疫苗核酸疫苗30死疫苗死疫苗（killedvaccine）：用物理、化學(xué)方法殺死病原微生物，但仍保持其免疫原性的生物制劑。常用的有：傷寒、霍亂、流行性腦膜炎、鉤端螺旋體病等滅活疫苗。31活疫苗（減毒活疫苗）減毒活疫苗（attenuatedvaccine）是通過毒力變異或人工選擇法（如溫度敏感株）而獲得的減毒或無毒株，或從自然界直接選擇出來的弱毒或無毒株經(jīng)培養(yǎng)后制成的疫苗。常用的有：BCG、鼠疫、炭疽、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹等減毒活疫苗。32活疫苗與死疫苗的比較區(qū)別點(diǎn)活疫苗死疫苗制品特點(diǎn)減毒或無毒的疫苗死菌，仍保持免疫原性制備方法通過非正常培養(yǎng)減毒株通過物理化學(xué)方法使病原體失活接種次數(shù)和接種量1次，量小2～3次，量大接種反應(yīng)可在體內(nèi)增殖，類似輕型感染或隱性感染在體內(nèi)不增殖，可出現(xiàn)發(fā)熱、全身或局部腫痛等反應(yīng)免疫的類型體液免疫和細(xì)胞免疫體液免疫免疫效果1～5年0.5～1年毒力回升與安全性有可能，對免疫缺陷者有危險(xiǎn)不可能，安全性好疫苗的穩(wěn)定性相對不穩(wěn)定相對穩(wěn)定保存不易保存，4℃存活2周，真空凍干可長期保存易保存，4℃可保存1年以上33新型疫苗亞單位疫苗基因工程疫苗核酸疫苗重組載體疫苗34亞單位疫苗利用微生物的保護(hù)性抗原制成的不含有核酸、能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的疫苗，稱為亞單位疫苗（subunitvaccine）。舉例肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌和流感嗜血桿菌表面的莢膜多糖，鉤端螺旋體的外膜蛋白等。35基因工程疫苗利用基因工程技術(shù)把編碼病原體保護(hù)性抗原表位的目的基因，導(dǎo)入原核或真核表達(dá)系統(tǒng)后，用表達(dá)的保護(hù)性抗原所制成疫苗稱為基因工程疫苗（geneengineeredvaccine）。36重組載體疫苗

將編碼某一蛋白抗原的基因轉(zhuǎn)入減毒的病毒或細(xì)菌而制成的疫苗。轉(zhuǎn)入的目的基因可整合到細(xì)菌或病毒的基因組上或以質(zhì)粒的形式存在。37核酸疫苗核酸疫苗（nucleicacidvaccine）也稱DNA疫苗。是將編碼保護(hù)性抗原的基因重組到質(zhì)粒真核表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到宿主體內(nèi)，外源基因在體內(nèi)所表達(dá)的抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。38類毒素外毒素經(jīng)0.3%～0.4%甲醛處理后，失去了毒性但仍保持免疫原性的生物制品。加入吸附劑（佐劑）氫氧化鋁后便制成精制類毒素（toxoid）。吸附劑可延緩類毒素在體內(nèi)的吸收時(shí)間，刺激機(jī)體產(chǎn)生足量的抗毒素。舉例：白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素39二、人工被動免疫人工被動免疫（artificialpassiveimmunization）是輸入含有特異性抗體的免疫血清、純化免疫球蛋白抗體或細(xì)胞因子等免疫制劑，使機(jī)體立即獲得特異性免疫力的過程，可用于某些急性傳染病的緊急預(yù)防和治療。40抗毒素(antitoxin)將類毒素或外毒素給馬進(jìn)行多次免疫后，待馬匹產(chǎn)生高效價(jià)抗體后采血，分離血清，提取其免疫球蛋白精制成抗毒素制劑。主要用于外毒素所致疾病的治療和緊急預(yù)防。臨床常用的有破傷風(fēng)、白喉精制抗毒素、肉毒抗毒素以及氣性壞疽多價(jià)抗毒素等。使用這種異種抗毒素時(shí)應(yīng)注意避免Ⅰ型超敏反應(yīng)的發(fā)生。41丙種球蛋白血清丙種球蛋白是從正常人血漿中提取的丙種球蛋白制劑。胎盤丙種球蛋白是從健康產(chǎn)婦的胎盤或嬰兒臍帶血液中提制而成，主要含有丙種球蛋白。主要用于對某些疾病的應(yīng)急預(yù)防及燒傷患者預(yù)防細(xì)菌感染。42兩種人工免疫方法的比較區(qū)別點(diǎn)人工主動免疫人工被動免疫免疫物質(zhì)抗原抗體或細(xì)胞因子等接種次數(shù)1～3次1次免疫出現(xiàn)時(shí)間慢（注射后2～4w）快（注射后立即出現(xiàn)）免疫維持時(shí)間長（數(shù)月～數(shù)年）短（2～3w）用途多用于預(yù)防多用于治療或緊急預(yù)防43第三節(jié)細(xì)菌感染的治療原則44主要采用抗菌藥物來治療細(xì)菌感染?？咕幬镆话闶侵妇哂袣⒕蛞志钚缘乃幬镆约坝晌⑸锖铣傻目股仡愃幬?。正確合理應(yīng)用抗菌藥物是提高療效、降低不良反應(yīng)發(fā)生率以及減少或減緩細(xì)菌耐藥性發(fā)生的關(guān)鍵。45抗菌藥物治療性應(yīng)用的基本原則診斷為細(xì)菌性感染者，方有指征應(yīng)用抗菌藥物；盡早查明感染病原，根據(jù)病原種類及細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果選用抗菌藥物；按照藥物的抗菌作用特點(diǎn)及其體內(nèi)過程特點(diǎn)選擇用藥；抗菌藥物治療方案應(yīng)綜合患者病情、病原菌種類及抗菌藥物特點(diǎn)制訂。46復(fù)習(xí)思考題取腦脊液進(jìn)行細(xì)菌感染的檢查，用什么免疫學(xué)方法可以進(jìn)行快速診斷？檢查病原菌抗原和血清中的特異性抗體選用的免疫學(xué)方法相同嗎？為什么？自動微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)的原理和特點(diǎn)是什么？若檢測細(xì)菌核酸，可選擇的實(shí)驗(yàn)方法有哪些？其原理與特點(diǎn)是什么？緊急預(yù)防細(xì)菌感染時(shí)應(yīng)采用的方法是什么？為什么？47課外閱讀資料目錄《微生物學(xué)史》，宋大康著，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2009臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)（第五版），倪語星、尚紅主編，人民衛(wèi)生出版社，201248中英文關(guān)鍵詞血清學(xué)診斷serologicaldiagnosis最低抑菌濃度minimuminhibitoryconcentration,MIC最低殺菌濃度minimumbactericidalconcentration,MBC基因芯片技術(shù)genechips人工主動免疫artificial