生物技術(shù)的親和色譜

生物技術(shù)的親和色譜

親和色度法采用偶聯(lián)親和形成的親水吸附介質(zhì)作為固定相和親水吸附的目標(biāo)產(chǎn)物，并對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行分離和提取。親和色譜已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物分子的分離和純化,如結(jié)合蛋白、酶、抑制劑、抗原、抗體、激素、激素素受體、糖蛋白、核酸及多糖類等;也可以用于分離細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等。親和層析技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)在于:利用它可以從粗提物中經(jīng)過(guò)一些簡(jiǎn)單的處理便可得到所需的高純度活性物質(zhì)。利用親和層析技術(shù)成功地分離了單克隆抗體、人生長(zhǎng)因子、細(xì)胞分裂素、激素、血液凝固因子、纖維蛋白溶酶、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素等產(chǎn)品,親和層析技術(shù)是目前分離純化藥物蛋白等生物大分子最重要的方法之一。親和色譜技術(shù)有效地集合了化工與生物技術(shù),是生物化工的重要發(fā)展方向。本文綜述了親和色譜技術(shù)的研究進(jìn)展。1大規(guī)模使用培養(yǎng)基抗原和抗體的作用具有高度的專一性,并且它們的結(jié)合親和力極強(qiáng)。因此用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結(jié)合到吸附劑上,便可有效地分離和純化免疫物質(zhì)。單抗問(wèn)世后,不少生物技術(shù)公司在研制適宜于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的生物反應(yīng)器及其培養(yǎng)基。這些大規(guī)模生產(chǎn)單抗技術(shù)的建立和不斷完善,將降低免疫親和色譜吸附劑的價(jià)格。隨著新的合成基質(zhì)和偶聯(lián)化合物的出現(xiàn)以及對(duì)免疫親和色譜研究的深入,必將使免疫親和色譜在工業(yè)性生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)的應(yīng)用上逐漸得到發(fā)展。趙益明、何楊等報(bào)道,用單克隆抗體親和色譜從人血小板破碎液中純化血小板第4因子(PF4)。將單克隆抗體Sz-95-LgG與溴化氰活化的Spharose4B凝膠連接成親和色譜柱B,人血小板破碎液經(jīng)此親和色譜柱上樣后,經(jīng)洗脫獲得PF4。結(jié)果表明,Sz-95-Sepharose4B親和色譜柱的偶聯(lián)率為72%,每1mL血小板破碎液中可以純化到PF418μg。2金屬離子絡(luò)合成鹽和傳統(tǒng)的親和色譜相比,固定化金屬離子親和色譜具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)配基穩(wěn)定性高,不易脫落;(2)金屬離子配基價(jià)格低廉,再生成本低;(3)可在高鹽濃度下操作,從而省去了脫鹽的預(yù)處理步驟,而且可以減少非特異性吸附;(4)蛋白質(zhì)洗脫比較容易,采用較低pH或采用競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)如咪唑、EDTA,便可將吸附蛋白解吸下來(lái)。金屬離子親和色譜是利用金屬離子的絡(luò)合或形成螯合物的能力來(lái)吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。目的蛋白質(zhì)表面暴露的供電子氨基酸殘基,如組氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基,十分有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合。鋅和銅巳發(fā)現(xiàn)能很好地與組氨酸的咪唑基巰基結(jié)合。LarryRiggs等設(shè)計(jì)了一種利用多級(jí)色譜分離蛋白質(zhì)的方案。其中所用的親和色譜柱為Ca(III)-IMAC系統(tǒng)。利用磷酸化肽與Ca的親和能力,研究人員用該柱選擇性地結(jié)合被胰蛋白酶消化的牛奶中的磷酸化肽,效果極好。制備了以殼聚糖為載體的金屬螯合親和色譜分離純化還原犁谷胱甘肽(GSH)。研究了pH、銨離子濃度等對(duì)GSH洗脫的影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定洗脫液pH為4.2、0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/LNH4Cl),所得GSH純度可達(dá)49.8%,平均提取率為67.9%。3仿生親和小分子配基新技術(shù)近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的以氨基酸(包括多肽)親和色譜和染料親和色譜為代表的仿生親和小分子配基新技術(shù)。對(duì)需要純化的目標(biāo)蛋白,在組合生物分子庫(kù)和組合化學(xué)分子庫(kù)中篩選其相應(yīng)的親和配基,然后將其固定到支持介質(zhì)上,這種組合出來(lái)的親和配基比天然生物分子性質(zhì)更穩(wěn)定,特異性及重復(fù)性更好。3.1模擬型篩選用于化學(xué)成分篩選和活性成分穩(wěn)定性的應(yīng)用染料配基能通過(guò)共價(jià)鏈牢固地結(jié)合到親和載體上。染料配基價(jià)格低廉,與蛋白質(zhì)的結(jié)合容量大,并且不易為物理或化學(xué)物質(zhì)所降解,因此是一種較為理想的基團(tuán)特異性配基。S.C.MeLissis等研究了谷胱甘肽結(jié)構(gòu)類似物親和吸附劑。所用的染料是二氯三嗪的模擬物,其中活性部分結(jié)構(gòu)與谷胱甘肽類似。用此種親和吸附劑分別純化三種作用于谷胱甘肽的酶NAD+、甲醛脫氫酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶,效果良好。3.2離子束純化技術(shù)與金屬和染料相比,多肽具有較高的特異性,且通常是無(wú)毒的。多肽具有與蛋白質(zhì)相似的結(jié)構(gòu),因此它們的作用通常是溫和的,因此在分離過(guò)程中采取溫和的洗脫條件,可以避免蛋白質(zhì)的變性。H.Arostova等用碘化的L-酯氨酸與瓊脂糖交聯(lián)制備親和色譜柱純化豬胃蛋白酶,效果良好。John等合成的雙環(huán)八肽類似物,對(duì)腸促胰酶肽有很好的特異性吸附。然而,自然界中存在的與蛋白質(zhì)等生物大分子有天然親和性的多肽種類非常有限。因此,必須找到并得到合適的特異性多肽。組合化學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展將為這一發(fā)展方向開辟道路。4和其他技術(shù)的聯(lián)合光譜技術(shù)過(guò)程集成(ProcessIntegration)是一般化工加工過(guò)程的重要研究方向。以下將對(duì)一些集成化的親和色譜技術(shù)分別進(jìn)行介紹。4.1分離技術(shù)的應(yīng)用親和膜分離(AfinityMembraneSeparation)是將親和色譜與膜分離技術(shù)結(jié)合起來(lái)以提高過(guò)程選擇性的一項(xiàng)新型分離技術(shù)。親和膜分離技術(shù),綜合了兩種方法的優(yōu)點(diǎn),而且互相互補(bǔ)克服缺點(diǎn),具有傳質(zhì)阻力小、壓降低、設(shè)備體積小、配基利用率高等優(yōu)點(diǎn)。親和膜過(guò)濾技術(shù)研究的最早報(bào)道見于1980年。在國(guó)內(nèi),巳報(bào)道用于血清中內(nèi)毒素等的分離純化。4.2電泳分離技術(shù)電泳親和色譜技術(shù)(ElectrophoresisAffinityChromatography)是將電泳與親和色譜相結(jié)合形成一種新型制備規(guī)模的生物分離技術(shù)。其基本思想是利用電場(chǎng)強(qiáng)化擴(kuò)散過(guò)程以加速分離過(guò)程的進(jìn)行。LiuZ等發(fā)現(xiàn)親和色譜過(guò)程施加電場(chǎng)后吸附過(guò)程的傳質(zhì)速率加快,動(dòng)態(tài)吸附容量提高。4.3高傳統(tǒng)生物技術(shù)磁性分離技術(shù)中引入磁性介質(zhì),在操作時(shí)通過(guò)外加磁場(chǎng)的作用,可以提高傳統(tǒng)生物分離技術(shù)的效率。Safank等則探討了利用磁性顆粒進(jìn)行細(xì)胞分離的方法。郭立安等合成了能用于萬(wàn)古霉素純化用的磁性親和載體,并從發(fā)酵液中一步純化得到,可得到純度達(dá)97%以上的純品。4.4膨脹床吸附技術(shù)傳統(tǒng)色譜過(guò)程的最大不足是不能處理含固體顆粒的料液,20世紀(jì)90年代產(chǎn)生的膨脹床吸附技術(shù),將固-液流態(tài)化技術(shù)與色譜過(guò)程偶合,使吸附和淋洗過(guò)程大大加快