包涵體復(fù)性注意事項(xiàng)和常見問題解析

包涵體復(fù)性注意事項(xiàng)和常見問題解析返回:包涵體復(fù)性介紹及包涵體復(fù)性操作方法包涵體復(fù)性注意事項(xiàng).最適PH值范圍為8.0-9.0之間；.溫度適宜選擇4℃;.復(fù)性過程蛋白濃度不宜過大,一般為0.1-0.2mg∕mL;.復(fù)性時間一般為24-36小時;.低分子化合物如L-Arg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度;脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等,在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑,都可阻止蛋白聚集;Tris對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用;EDTA可以防止蛋白降解；.首先要獲得較高純度的包涵體;.包涵體溶解要徹底,一般應(yīng)使溶解液體量較大,不要怕蛋白被稀釋,要有助溶措施;.透析前后均要離心;.包含體要徹底洗滌干凈,洗滌液中加入適量Triton-X100;.包含體溶解后裝入透析袋在復(fù)性液中復(fù)性;.復(fù)性完畢在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析12-24h;.復(fù)性率的測定時要據(jù)變性蛋白和非變性蛋白的光學(xué)性質(zhì)不同測定.TritionX100、SDS這一類去垢劑最后不易去除,在制藥行業(yè)中一般不允許采用。用TritOn洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步，改變培養(yǎng)條件,再洗滌包涵體,有時可以在上柱前已經(jīng)只剩下3-4條雜帶,這樣后續(xù)的純化就很方便了。.復(fù)性時的蛋白濃度一般為0.1-1mg/ml,太高的濃度容易形成聚體沉淀,太低的濃度不經(jīng)濟(jì),而且很多蛋白在低濃度時不穩(wěn)定,很容易變性。包涵體復(fù)性常見問題分析包涵體復(fù)性原則低濃度,平緩梯度,低溫。怎樣洗滌包涵體?通常的洗滌方法一般是洗不干凈的,可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分,過濾除去未溶解的物質(zhì),注意留樣跑電泳,然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳,如此類推可以一直稀釋到合適的濃度,可以找到一個合適去除雜質(zhì)的辦法,其實(shí)這就是梯度沉淀的方法,比通常的直接洗脫效果好。對于尿素和鹽酸胍該怎么選擇尿素和鹽酸胍屬中強(qiáng)度變性劑,易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用,所需濃度尿素8-10M,鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱,溶解度為70-90%,尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽,對重組蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行共價修飾,但用尿素溶解具有不電離,呈中性,成本低,蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn),故目前已被廣泛采用。鹽酸胍溶解能力達(dá)95%以上,且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點(diǎn)。8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存？在4度放置半個月,都沒什么問題。在室溫放置超過48小時,可能會對目的蛋白有影響，因?yàn)槟蛩卦趬A性條件下可使一些氨基酸?；?所以早些處理BI溶液比較好。復(fù)性時的蛋白濃度一般使用濃度為0.1-1mg/ml,太高的濃度容易形成聚體沉淀,太低的濃度不經(jīng)濟(jì),而且很多蛋白在低濃度時不穩(wěn)定,很容易變性。蛋白復(fù)性后濃度低蛋白可能是在復(fù)性的過程中發(fā)生降解了?？梢詫?fù)性好的蛋白濃縮一下跑膠看看。復(fù)性過程一般都是低濃度蛋白,需要保證分子間有足夠的折疊空間。一些未正確折疊的蛋白就存在于沉淀中,可能沉淀看不出來,復(fù)性后的蛋白高速離心看看。復(fù)性中蛋白析出是怎么回事?該怎么處理?出現(xiàn)蛋白析出,肯定是條件變化太劇烈了。復(fù)性應(yīng)該采取復(fù)性液濃度和PH值逐漸變化的方法,例如根據(jù)包涵體的溶液成分,每隔1個PH或濃度值配置一種溶液,逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低,條件溫和,使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。但是復(fù)性的比率應(yīng)該很低。若加變性劑尿素可加到2M,鹽酸胍可加到1-1.5M;另外可將甘油濃度增加,范圍可在≤30%,且在復(fù)性樣品中也可加適量甘油。復(fù)性效果的檢測根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要,可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測。1.凝膠電泳:一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì),或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對情況。.光譜學(xué)方法:可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜(CD)等,利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測,但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測。.色譜方法:如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。.生物學(xué)活性及比活測定:一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測定,較好的反映了復(fù)性蛋白的活性,值得注意的是,不同的測活方法測得的結(jié)果不同,而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。5.黏度和濁度測定:復(fù)性后的蛋白溶解度增加,變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露,一般水溶性很差,大多形成可見的沉淀析出。6.免疫學(xué)方法:如ELISA、WESTERN等,特別是對結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。變性的融合蛋白可以制備多抗或者單抗嗎?變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產(chǎn)物,用來免疫動物具有更強(qiáng)的抗原性。只是天然蛋白中被包在內(nèi)部的抗原決定簇也會暴露出來,如果用該變性抗原制備的抗體來檢測變性抗原是可以的,如果用來檢測天然蛋白,可能會有假陽性。做單抗也可以,同樣道理,篩選出的單抗可能對抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部,是否能用還要看將來該單抗用來干什么。純化