免疫組化中的陽性對照與陰性對照如何設(shè)置

免疫組化中的陽性對照與陰性對照如何設(shè)置之五兆芳芳創(chuàng)作問題：免疫組化中的陽性對照與陰性對照如何設(shè)置？參考見地1：陽性對照：已知含有要測的抗原的組織.陰性對照：可以做幾種：空白對照：免去一抗代替對照：免疫前血清代替一抗已知陰性組織抑制試驗(yàn)：未標(biāo)識表記標(biāo)幟抗體要發(fā)文章建議做代替對照.參考見地2：樓上答復(fù)的真好，不過組織內(nèi)對照的公道使用可以免去設(shè)置實(shí)驗(yàn)對照的良多麻煩！問題：免疫組化技巧(田0的優(yōu)點(diǎn)是什么參考見地：1．特異性強(qiáng)免疫學(xué)的基來源根底理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白(keratin)顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細(xì)胞成分.只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在穿插抗原時才會出現(xiàn)穿插反響.2．敏理性高在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技巧上的限制，只有直接法、直接法等敏理性不高的技巧，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏理性的抗體抗原反響，使免疫組化辦法越來越便利地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷任務(wù).3．定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功效相結(jié)合該技巧通過抗原抗體反響及呈色反響，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時對不合抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位不雅察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功效相結(jié)合的研究，對病理學(xué)研究的深入是十分有意義的.免疫組化罕有問題的處理參考意見：當(dāng)免疫組化染色沒有出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果時，應(yīng)系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因.對照/標(biāo)本無染色①確認(rèn)是否疏忽了應(yīng)該加的某種試劑，包含一抗、二抗、三抗及底物等.②確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序參加，是否孵育了足夠的時間.③對照抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點(diǎn)是很是重要的.比方，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗.④查抄抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液.⑤查抄抗體的有效期和保管條件，尤其是標(biāo)識表記標(biāo)幟了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保管，應(yīng)避免頻頻凍融，試劑保管時一定要避免與揮發(fā)性有機(jī)溶劑同放一室，以免下降抗體的效價(jià).⑥查抄標(biāo)本的儲存條件，最好用已知陽性的標(biāo)原本同時做陽性對照.⑦查抄色原/底物溶液，最復(fù)雜的檢測辦法是將一滴標(biāo)識表記標(biāo)幟有酶的抗體參加到制備好的底物溶液中，如果底物產(chǎn)生預(yù)期的顏色變更，則可排除底物的因素.需要注意的是，有些底物在制成任務(wù)液后應(yīng)在一定時間內(nèi)用完，不然會失效.⑧查抄沖洗液是否和反響試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不該含有疊氮鈉.⑨查抄復(fù)染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配.弱陽性如果陰性對照沒有染色而陽性對照標(biāo)本弱陽性，除了考慮上述因素外，還應(yīng)考慮：①標(biāo)本的固定方法，不當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ɑ蚬潭〞r溫度太高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質(zhì)量.②不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方法，由于石蠟切片在制作的進(jìn)程中固定劑對抗原的封鎖作用，必須用抗原熱修復(fù)或酶消化或兩種同時使用的抗原雙流露法，至于使用哪一種辦法，應(yīng)參照生產(chǎn)廠家的說明，同時結(jié)合標(biāo)本的具體情況而定.③抗體的稀釋度是否太高或孵育的溫度/時間是否正確.一般試劑生產(chǎn)廠家都會對試劑給出一定的使用規(guī)模，但是由于使用者的標(biāo)原本自各類組織，處理進(jìn)程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用規(guī)模，對所使用的一抗進(jìn)行梯度測試，找出最佳的使用濃度.④切片上遺留了過量的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋.⑤孵育時切片是否放置水平，不然會導(dǎo)致抗體流失.如果陰性對照沒有反響，陽性對照反響良好，而標(biāo)本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方法不合等原因所致.非特異性染色①是否有效地去除了內(nèi)源性酶和生物素.應(yīng)注意的是，其實(shí)不是每一種組織均需要進(jìn)行此步調(diào)，但對于內(nèi)源性酶或生物素豐厚的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因.處理的辦法為：滅活堿性磷酸酶：最經(jīng)常使用的辦法是將左旋咪唑（24mg/m1）參加底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分外源性堿性磷酸酶，對于仍能攪擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制.飽和處理內(nèi)源性生物素：消除內(nèi)源性生物素的辦法是事先滴加親和素，以飽和內(nèi)源性生物素，使之不再有剩余的結(jié)合位點(diǎn).具體辦法是在ABC法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15分鐘，PBS清洗15分鐘后便可染色.②是否選擇使用了正確的封鎖血清.電荷吸附所造成的非特異性布景染色消除辦法是以二抗動物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封鎖吸附位點(diǎn)有時其它無關(guān)蛋白，如牛血清白蛋白也常應(yīng)用.另外，取材時避開出血、壞死區(qū)亦極重要.最近有些國際的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用5%脫脂奶粉替代血清進(jìn)行抗原封鎖，效果也不錯.③所選擇的抗體是否合適試驗(yàn)要求.因抗原不純、標(biāo)本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過采取高純度、高效價(jià)的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決.④一抗的使用濃度是否太高.⑤清洗是否充分.應(yīng)嚴(yán)格操縱規(guī)程.因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低布景著色，通常0.05mol/lTris—HCl，0.15mol/lNaCl已適用于多數(shù)染色辦法，溶液內(nèi)參加吐溫20，效果更佳.特殊標(biāo)識表記標(biāo)幟時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方.⑥D(zhuǎn)BA的使用是否正確.DAB的孵育時間和配制方法可以產(chǎn)生某些布景顏色，使用濃縮型DAB試劑盒時，請嚴(yán)格依照說明書標(biāo)明的滴加順序操縱，注意校正蒸餾水的pH值，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性；粉劑DAB溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經(jīng)過濾除去，不然可能沉積于切片組織上，產(chǎn)生斑點(diǎn)狀著色.另外，DAB保管不當(dāng)產(chǎn)生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將DAB保管于避光枯燥處，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加H2O2.孵育時間太長也會造成布景染色.⑦標(biāo)本染色進(jìn)程中是否曾干枯，不然會造成邊沿部的非特異性染色.⑧查抄二抗與標(biāo)本的內(nèi)源性組織蛋白是否有穿插反響.1、染色過強(qiáng)原因－－－解決辦法A、抗體的濃度太高或抗體孵育時間太長——下降抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體孵育時間：室溫1小時或4℃留宿8、孵育溫度太高，孵育溫度超出37℃ 一般室溫20-28℃C、DAB顯色時間太長或DAB濃度太高 顯色時間不克不及超出5-10分鐘，以顯微鏡下不雅察為準(zhǔn)2、非特異性布景染色原因－－－解決辦法A、操縱進(jìn)程中沖洗不充分——每步?jīng)_洗3x5B、組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封鎖，孵育時間延長C、組織中含內(nèi)源性生物素 正常非免疫動物血清再封鎖D、血清蛋白封鎖不充分——延長血清蛋白封鎖時間3、染色弱原因－－－解決辦法A、抗體濃度太低，孵育時間太短 提高抗體濃度，孵育時間不克不及少于60分鐘B、試劑超出有效使用期——實(shí)時改換試劑C、操縱中，滴加試劑時緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋--－每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但避免切片枯燥）口、室溫太低，低于15℃——若室溫低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘（或4℃冰箱留宿）E、蛋白封鎖過度——封鎖時間不要超出10分鐘4、染色陰性原因－－－解決辦法A、操縱步調(diào)錯誤——重新試驗(yàn)，設(shè)立陽性對照B、組織中無抗原——設(shè)立陽性對照片，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果C、一抗與二抗種屬連接錯誤——仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無誤【請教】免疫組化陽性、陰性對照的問題列位大蝦，我做了大鼠組織的TNF-a免疫組化，是取材后

送到醫(yī)院病理科出錢代做的，現(xiàn)HE和免疫組化片子已經(jīng)做

好，我才意識到?jīng)]有陽性和陰性對照，請問這兩種對照該

怎么弄，是我自己想辦法仍是該病理科擔(dān)任給我設(shè)立？需

要我自己再買相應(yīng)的試劑嗎？以前沒有做過，所以一頭霧

水，請不吝賜教，多謝!免疫組化的同一批片子中要有陽性對照和陰性對照才有意

義,這些應(yīng)該是同時作出來的,事后無法解救.陽性對照片在購

試劑時可以要求附兩張?jiān)噭┕镜年栃云?如果沒有,也可

以自已弄,我做的時候是用腫瘤組織作陽性對照,實(shí)驗(yàn)動物組

織不加一抗作陰性對照,你可以按照自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)立陽性對

照,不必再采辦試劑.團(tuán)體見地,希望對你有幫忙.

免疫組化染色中的對照片的設(shè)置很是重要，它是判斷您的

染色是否成功的關(guān)頭依據(jù)，并且也是檢測每一個抗體的質(zhì)

量尺度，常設(shè)的對照如下：自身對照、陰性對照（空白對

照、替代對照、抑制對照、吸收實(shí)驗(yàn)對照）、陽性對照.人、自身對照：在同一切片上與檢測的目的物對照比較.如

Actin、CD34在正常組織中的血管壁肌層應(yīng)為陽性，Vimentin可以間質(zhì)細(xì)胞，Desmin以血管壁及肌束為對照，

S-100以小神經(jīng)末為對照等，如果應(yīng)為陽性的組織是陽性，

則技