2005國(guó)際clsiccls-m100藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)指南解讀

2005國(guó)際clsiccls-m100藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)指南解讀

在大多數(shù)國(guó)家，美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室（cnis）推薦的藥物過敏試驗(yàn)方法和評(píng)估基準(zhǔn)。2005年該委員會(huì)更名為臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI),考慮到大多數(shù)國(guó)家地區(qū)的習(xí)慣,在過渡時(shí)期暫時(shí)稱為CLSI/NCCLS,其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)改稱為CLSI文件。CLSI/NCCLS-M100藥敏測(cè)定指南為適應(yīng)臨床實(shí)際工作的需要,每年都會(huì)依實(shí)際情況加以更新和修訂。2005版CLSI/NCCLSM100-S15的主要增補(bǔ)內(nèi)容包括藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)溫度、達(dá)托霉素藥敏試驗(yàn)和報(bào)告、藥敏試驗(yàn)質(zhì)量保證菌株的使用、β-溶血鏈球菌克林霉素誘導(dǎo)耐藥的檢測(cè)、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰氨酶菌株(ESBL)篩選試驗(yàn)及確證試驗(yàn)在奇異變形桿菌中的應(yīng)用、腦膜炎奈瑟球菌的藥敏試驗(yàn)等內(nèi)容。本文就相關(guān)內(nèi)容予以介紹,以使國(guó)內(nèi)業(yè)界同行們對(duì)此有一定的了解。一、假陽性鑒定難1.葡萄球菌屬33~35℃,不要超過35℃。其原因是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和MRCNS的鑒定在超過35℃時(shí)存在假陽性問題。2.其他細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)溫度在35℃±2℃。二、達(dá)托激素的作用機(jī)制達(dá)托霉素是由美國(guó)禮來公司最初研究,Cubist制藥公司開發(fā)的一環(huán)脂肽類抗生素。2003年底,美國(guó)食品與藥品管理局經(jīng)過快速審理程序批準(zhǔn)注射用達(dá)托霉素用于治療由一些革蘭氏陽性敏感菌引起的并發(fā)性皮膚感染及皮膚感染。達(dá)托霉素的作用機(jī)制與其他抗生素不同,它通過擾亂細(xì)胞膜對(duì)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn),從而阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的生物合成。此外,它還能通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜,使其內(nèi)容物外泄而達(dá)到殺菌的目的。達(dá)托霉素對(duì)葡萄球菌和腸球菌的判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。達(dá)托霉素僅限于對(duì)葡萄球菌、腸球菌和β溶血鏈球菌的藥敏試驗(yàn),當(dāng)出現(xiàn)非敏感結(jié)果時(shí),應(yīng)重新鑒定菌種和重復(fù)藥敏試驗(yàn)。值得注意的是紙片擴(kuò)散法很難發(fā)現(xiàn)對(duì)達(dá)托霉素敏感性降低的葡萄球菌最低抑菌濃度(MIC>1μg/ml)和腸球菌(MIC>4μg/ml),臨床治療的失敗可能由于紙片擴(kuò)散法判定為“S”菌株,而實(shí)際上對(duì)達(dá)托霉素敏感性降低。三、質(zhì)控和質(zhì)量保證試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法中,最常用的質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922,金黃色葡萄球菌ATCC25923和銅綠假單胞菌ATCC27853。測(cè)定MIC最常用的菌株為大腸埃希菌ATCC25922,金黃色葡萄球菌ATCC29213和銅綠假單胞菌ATCC27853。在檢測(cè)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株時(shí),必須增加肺炎克雷伯菌ATCC700603作為質(zhì)控菌株。每日或每周進(jìn)行質(zhì)控試驗(yàn)可以保證得到準(zhǔn)確的結(jié)果。當(dāng)質(zhì)控結(jié)果可以接受時(shí)說明藥敏試驗(yàn)所使用設(shè)備、試劑、培養(yǎng)基及耗材和試驗(yàn)過程是符合要求的。如在“D”試驗(yàn)使用金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌株。使用ATCC菌種進(jìn)行質(zhì)量保證,其目的是訓(xùn)練操作人員如何準(zhǔn)確地進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并得到可靠的結(jié)果,保證每個(gè)操作者具有正確進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的能力。同時(shí),還可用以評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如2005版CLSI/NCCLS在“D”試驗(yàn)中增加QA菌株金黃色葡萄球菌ATCCBAA-976(msrA)和金黃色葡萄球菌ATCCBAA-977(ermA),分別作為“D”試驗(yàn)陰性和陽性結(jié)果的對(duì)照。對(duì)產(chǎn)ESBL篩選和確證試驗(yàn)時(shí)也應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)控和質(zhì)保菌株的試驗(yàn)(表2)。由于肺炎克雷伯菌ATCC700603的ESBL基因存在于質(zhì)粒上,因此應(yīng)保存該菌在-60℃或者更低的環(huán)境下。四、產(chǎn)esbl的異變形桿菌的篩選奇異變形桿菌-ESBL試驗(yàn):奇異變形桿菌產(chǎn)ESBL菌株在美國(guó)罕見,有報(bào)道在171株奇異變形桿菌中僅1株為產(chǎn)ESBL株。因此,2005版CLSI/NCCLS并不推薦對(duì)奇異變形桿菌進(jìn)行常規(guī)ESBL篩選試驗(yàn)。但在某些地區(qū)如歐洲、南美等地,產(chǎn)ESBL的奇異變形桿菌分離率較高,常引起醫(yī)院感染的暴發(fā)。當(dāng)從患者無菌部位分離到奇異變形桿菌,特別是當(dāng)奇異變形桿菌所引起的菌血癥時(shí),有必要與臨床醫(yī)生商議進(jìn)行ESBL試驗(yàn)。2005版CLSI/NCCLS所規(guī)定的奇異變形桿菌的ESBL篩選試驗(yàn)與大腸埃希菌、產(chǎn)酸和肺炎克雷伯菌篩選試驗(yàn)有所不同,其中頭孢泊肟的MIC值為≥2μg/ml。確證試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)與大腸埃希菌、產(chǎn)酸和肺炎克雷伯菌的相同。奇異變形桿菌ESBLS篩選試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)見表3。五、抗感染藥物的敏感試驗(yàn)2005版CLSI/NCCLSM7(MIC)表建議對(duì)不動(dòng)桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜麥芽窄食單胞菌(不包括銅綠假單胞菌)可常規(guī)進(jìn)行以下藥物的敏感性試驗(yàn),包括替卡西林/克拉維酸、復(fù)方磺胺甲噁唑、頭孢噻肟或頭孢曲松、氯霉素、頭孢唑肟和四環(huán)素。而頭孢唑肟和四環(huán)素僅限于尿道分離株的MIC試驗(yàn)。近年來,多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌使臨床抗感染治療面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。對(duì)于慶大霉素、阿米卡星、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑均表現(xiàn)為耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌,需要加強(qiáng)臨床醫(yī)生與臨床微生物人員的溝通、會(huì)診;咨詢國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室的臨床微生物學(xué)專家;加做其他藥物的敏感試驗(yàn),如多粘菌素-E和多粘菌素-B。多粘菌素-E和多粘菌素-B的質(zhì)控范圍見表4。值得注意的是:(1)多粘菌素B的折點(diǎn)可用以推斷多粘菌素E的結(jié)果,≤2μg/ml為“S”、≥4μg/ml為“R”;(2)可向臨床醫(yī)生報(bào)告多粘菌素B的結(jié)果,并附可作為多粘菌素E的參考依據(jù)的意見;(3)多粘菌素紙片擴(kuò)散法不能鑒定某些耐藥株(主要是嗜麥芽窄食單胞菌和不動(dòng)桿菌);(4)銅綠假單胞菌對(duì)多粘菌素的耐藥株罕見。六、meca基因和pbpba檢測(cè)1.mecA基因介導(dǎo)耐藥2004年NCCLS曾建議用30μg頭孢西丁紙片代替1μg苯唑西林紙片檢測(cè)甲氧西林耐藥的葡萄球菌(MRS),其意義在于mecA基因在高濃度頭孢西丁存在的條件下比苯唑西林更易表達(dá)。檢測(cè)mecA基因和青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)是確證耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)最準(zhǔn)確的方法。雖然非mecA基因介導(dǎo)耐藥的機(jī)制罕見,但確實(shí)存在。因此,在紙片擴(kuò)散法確定為耐藥,加做苯唑西林MIC,當(dāng)≥4μg/ml時(shí),即使mecA基因和PBP2a檢測(cè)為陰性,也要報(bào)苯唑西林耐藥。對(duì)于表皮葡萄球菌頭孢西丁和苯唑西林的紙片擴(kuò)散法和苯唑西林MIC的判定標(biāo)準(zhǔn)是合適的,但對(duì)于其他凝固酶陰性葡萄球菌,如腐生葡萄球菌、路鄧葡萄球菌(slugdunensis)等菌種,該判定標(biāo)準(zhǔn)常造成耐藥率過高。因此,2005版CLSI/NCCLS對(duì)路鄧葡萄球菌苯唑西林的判定標(biāo)準(zhǔn)是使用金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)(表5)。金黃色葡萄球菌mecA基因介導(dǎo)耐藥的檢測(cè)方法,依次為mecA、PBP2a、頭孢西丁紙片法、苯唑西林紙片法或苯唑西林MIC。臨床微生物室常規(guī)試驗(yàn)結(jié)果可確定為,頭孢西丁紙片法=苯唑西林紙片法=苯唑西林MIC結(jié)果。凝固酶陰性葡萄球菌mecA基因介導(dǎo)耐藥的最好方法為mecA和PBP2a檢測(cè),常規(guī)試驗(yàn)中頭孢西丁紙片法優(yōu)于苯唑西林紙片法和MIC法(表6)。如果苯唑西林MIC判定為耐藥菌株加做頭孢西丁紙片法可消除假陽性,提高特異性。對(duì)于苯唑西林紙片檢測(cè)中介的金黃色葡萄球菌必須進(jìn)行mecA基因檢測(cè)、PBP2a檢測(cè)、頭孢西丁紙片法、苯唑西林高鹽瓊脂篩選試驗(yàn)或苯唑西林MIC測(cè)定,來確定是否為MRSA菌株。2.萬古霉素中介和萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(VISA/VRSA)的檢測(cè)近年來VISA/VRSA已引起有關(guān)人員的普遍關(guān)注,2005版CLSI/NCCLS推薦的方法見表7。3.葡萄球菌對(duì)某些氟喹諾酮藥物的判定標(biāo)準(zhǔn)的改變分別調(diào)整了葡萄球菌對(duì)氧氟沙星、加替沙星和左氧氟沙星紙片擴(kuò)散法和MIC的判定標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)增加了莫西沙星的MIC標(biāo)準(zhǔn),(表8、9)。七、克林激素和麻黃的藥敏試驗(yàn)2004版NCCLS推薦了葡萄球菌屬大環(huán)內(nèi)酯類耐藥機(jī)制的鑒別方法,2005版CLSI/NCCLS又將這一檢測(cè)方法應(yīng)用于β-溶血鏈球菌(包括A、B、C、Gβ-溶血鏈球菌)。β-溶血鏈球菌的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥機(jī)制主要為mef基因編碼的泵出機(jī)制、核糖體結(jié)構(gòu)型變異、核糖體可誘導(dǎo)變異三類。后兩類均為erm基因編碼,可使23SrRNA甲基化,第三類又稱為MLSb耐藥(M=大環(huán)內(nèi)酯類,L=林可霉素,Sb=鏈陽霉素B型)?！癉”試驗(yàn)又名克林霉素誘導(dǎo)試驗(yàn),在進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)時(shí),將紅霉素紙片(15μg/片)和克林霉素紙片(2μg/片)貼在鄰近的位置,間距(邊沿到邊沿)12mm、35℃±2℃培養(yǎng)20~24h。如靠近紅霉素紙片處克林霉素的抑菌環(huán)減小,呈英文大寫的D型,則判定為“D”試驗(yàn)陽性。為保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性,“D”試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)進(jìn)行QC菌金黃色葡萄球菌ATCC25923和QA菌金黃色葡萄球菌ATCCBAA-976(msrA)和ATCCBAA-977(ermA)的藥敏試驗(yàn)。B群鏈球菌是引起婦女妊娠期和圍產(chǎn)期感染的重要病原菌,對(duì)于分娩期和圍產(chǎn)期婦女預(yù)防性用藥,推薦使用青霉素和氨芐西林。但對(duì)青霉素過敏的高危者,建議使用克林霉素或者紅霉素。因此,當(dāng)從對(duì)青霉素過敏的妊娠婦女分離到B群鏈球菌時(shí),應(yīng)進(jìn)行克林霉素和紅霉素的“D”試驗(yàn)?？肆置顾爻收T導(dǎo)耐藥的菌株感染者,其中部分使用克林霉素治療是有效的,但臨床醫(yī)生應(yīng)予以注意。八、量資金與質(zhì)控菌株2004年底和2005年初,由腦膜炎奈瑟球菌所致的腦膜炎的暴發(fā)流行引起了社會(huì)普遍的關(guān)注。2005版CLSI/NCCLS增補(bǔ)腦膜炎奈瑟球菌的藥敏試驗(yàn)對(duì)于控制和預(yù)防細(xì)菌性腦膜炎具有重要意義。腦膜炎奈瑟球菌的MIC微量肉湯稀釋法的操作程序是從巧克力平板(20~24h生長(zhǎng)物)制備菌懸液,使用含2%~5%裂解馬血的調(diào)節(jié)過陽離子的MH肉湯,在5%CO2環(huán)境,35℃培養(yǎng)20~24h觀察結(jié)果。質(zhì)控菌株為肺炎鏈