分子生物學(xué)常用檢測(cè)技術(shù)

分子生物學(xué)常用檢測(cè)技術(shù)分子生物學(xué)常用檢測(cè)技術(shù)分子生物學(xué)常用檢測(cè)技術(shù)2021/2/422021/2/42DNA—四種核苷酸（A-T-C-G)組成的多聚骨架所有組成DNA的核苷酸dATP,dTTP,dCTP,dGTP都由三種成分組成：1）一個(gè)2’-脫氧核糖（戊糖）2）一個(gè)含氮堿基嘌呤：A\G嘧啶：T/C3）三個(gè)磷酸基團(tuán)各單個(gè)核苷酸由5’和3’-碳形成的磷酸二酯鍵連接在一起2021/2/43變性、復(fù)性、退火和淬火2021/2/44基因2021/2/45分子生物學(xué)常用技術(shù)

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）核酸分子雜交基因芯片技術(shù)(biochip)DNA測(cè)序（DNAsequencing）DNA重組技術(shù)(DNArecombination)2021/2/46

一、聚合酶鏈反應(yīng)

（PolymeraseChainReaction，PCR）體外基因擴(kuò)增技術(shù)

特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡(jiǎn)單、省時(shí)對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率的基因擴(kuò)增技術(shù)2021/2/47（一）PCR原理原理雙鏈DNA變性

退火鏈延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復(fù)2021/2/48PCR反應(yīng)體系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq

DNA聚合酶模板引物

和或和（二）PCR反應(yīng)的設(shè)計(jì)及影響因素2021/2/49PCR的種類(lèi)熒光定量PCR通用引物PCR多重PCR巢式PCRRT-PCR原位PCR免疫PCR……2021/2/410TaqMan探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'熒光定量PCR2021/2/411定量PCR的數(shù)學(xué)原理PCR理論方程N(yùn)=N0x(1+E)nN：擴(kuò)增數(shù)量N0：起始模板數(shù)量E：擴(kuò)增效率N：循環(huán)數(shù)

Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長(zhǎng)期Linear平臺(tái)期Plateauy=

N0(1+e)n指數(shù)增長(zhǎng)期Geometric2021/2/412定量PCR的數(shù)學(xué)原理Rn(熒光強(qiáng)度)循環(huán)數(shù)CycleNumber指數(shù)增長(zhǎng)期平臺(tái)期CT=-klogN0+bCt

（Cyclethreshold）值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值（threshold）時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。2021/2/413PCR的臨床應(yīng)用對(duì)病原微生物核酸進(jìn)行快速檢測(cè)彌補(bǔ)免疫檢測(cè)的缺陷縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）用于藥物療效監(jiān)測(cè)和評(píng)估用于腫瘤基因表達(dá)方面的研究用于遺傳病的診斷2021/2/414樣本采集要求2021/2/4152021/2/416二、核酸分子雜交根據(jù)核酸變性和復(fù)性的原理，不同來(lái)源的變性單鏈核酸分子在合適的條件下，通過(guò)堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交體的過(guò)程稱(chēng)為核酸分子雜交（molecularhybridization）。2021/2/4171、遺傳病的診斷2、病原體的鑒定3、癌基因突變的檢測(cè)4、組織配型5、親子鑒定核酸分子雜交的臨床應(yīng)用2021/2/418三、基因芯片技術(shù)基質(zhì)材料分，有尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等。2021/2/419

用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列原位合成法在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列2021/2/420基因芯片技術(shù)的應(yīng)用1、藥物篩選和新藥開(kāi)發(fā)2、疾病診斷3、環(huán)境保護(hù)4、司法5、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)2021/2/421四、測(cè)序技術(shù)CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT（一）一代測(cè)序技術(shù)2021/2/422（二）二代測(cè)序技術(shù)Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說(shuō)是目前全球使用量最大的第二代測(cè)序機(jī)器，這兩個(gè)系列的技術(shù)核心原理是相同的。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測(cè)序的基本原理是邊合成邊測(cè)序。在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)DNA的序列信息。2021/2/4232021/2/424技術(shù)特點(diǎn)比較第一代測(cè)序技術(shù)的主要特點(diǎn)是測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)1000bp，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，但其測(cè)序成本高，通量低等方面的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。第二代測(cè)序技術(shù)大大降低了測(cè)序成本的同時(shí)，還大幅提高了測(cè)序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，但在序列讀長(zhǎng)方面比起第一代測(cè)序技術(shù)則要短很多。2021/2/425五、基因重組技術(shù)基因重組是指一個(gè)基因的DNA序列是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的親本DNA組合起來(lái)的。基因重組是遺傳的基本現(xiàn)象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重組現(xiàn)象。2021/2/426轉(zhuǎn)基因植物

（抗蟲(chóng)、抗凍、抗病、高產(chǎn)）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因工程藥物和疫苗基因治療基因重組技術(shù)的應(yīng)用2021/2/427小結(jié)疾病的診斷感染性疾病診斷腫瘤性疾病診斷遺傳性疾病診斷組織配型