王鏡巖-生物化學(xué)I-第5章 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)-第6章 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

第五章蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)

1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分成四個(gè)層次:

primarystructure

一級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸序列

secondarystructure

二級(jí)結(jié)構(gòu)：α螺旋，β折疊

tertiarystructure

三級(jí)結(jié)構(gòu)：所有原子空間位置

quanternarystructure

四級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)多聚體

1969年正式將一級(jí)結(jié)構(gòu)定義為氨基酸序列和雙硫鍵的位置。介于二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間還存在超二級(jí)結(jié)構(gòu)（二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合）和結(jié)構(gòu)域（在空間上相對(duì)獨(dú)立）這兩個(gè)層次。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次肽基的C、O和N原子間的共振相互作用共振產(chǎn)生的重要結(jié)果：

限制繞肽鍵的自由旋轉(zhuǎn)

形成酰胺平面

產(chǎn)生鍵的平均化

肽鍵呈反式構(gòu)型sp2sp2sp2sp3共振雜化體歷史上第一個(gè)被確定

氨基酸序列的蛋白質(zhì)

胰島素

insulin胰島素的歷史第一個(gè)生化藥物最小的蛋白質(zhì)，由A鏈(21AA)和B(30AA)組成；動(dòng)物胰腺?細(xì)胞分泌的一種激素,告訴細(xì)胞往里面運(yùn)輸糖、氨基酸、K+；1921年Banting&Best從胰腺中抽提出了有活性的胰島素，1923年Banting&Macleod獲Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；1943－53年，Sanger確定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，1958年獲得Nobel化學(xué)獎(jiǎng)；1981年，Berg（因DNA重組技術(shù)得獎(jiǎng)）在大腸桿菌中表達(dá)了人胰島素.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟1、蛋白質(zhì)的分離純化

2、測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目3、亞基分離4、二硫鍵的拆分與保護(hù)5、分析每一多肽鏈的氨基酸組成6、鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基7、多種方法的部分水解8、測(cè)序9、重疊

10、二硫鍵位置的確定一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定策略蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定步驟N端的測(cè)定方法1、Sanger（二硝基氟苯）法2、丹磺酰氯法3、Edman法4、酶降解法氨基酸與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)

（sanger反應(yīng)）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色)++HF弱堿中氨基酸Sanger試劑(FDNB)標(biāo)記N末端Sanger試劑標(biāo)記反應(yīng)ABCDE↓*ABCDE↓*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE↓*A,*A+B,……*A+B+C+D+E↓*A,*A+*B,……*A+*B+*C+*D+*E

12345

結(jié)論：ABCDEFDNBFDNB完全水解部分水解Sanger試劑標(biāo)記測(cè)序H2N—CH—COOH+

RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOH

RDNS-氨基酸取代DNFB測(cè)定蛋白質(zhì)N端氨基酸，靈敏度高酰化反應(yīng)氨基酸與苯異硫氰酯（PITC）的反應(yīng)

（Edman反應(yīng)）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱鹼中(400

C)(硝基甲烷400

C)H+Edman降解法(I)DABITC：有色Edman試劑在Edman試劑上加發(fā)色基團(tuán)Edman降解法1Edman降解法(II)Edman降解法2無(wú)冕英雄PehrVictorEdman

瑞典人,1916.4.14-1977.3.191946-47年在美國(guó)留學(xué)時(shí)想到改進(jìn)1930年Abderhalden&Brockmann發(fā)明的

PITC試劑的反應(yīng),50年發(fā)明Edmandegradation反應(yīng).ActaChemScand4:283(1950)

1957年移居墨爾本,遠(yuǎn)離國(guó)際學(xué)術(shù)中心開(kāi)始過(guò)隱居生活,1967年研制的自動(dòng)化儀器可以達(dá)到每小時(shí)一個(gè)氨基酸的速度;他堅(jiān)持不申請(qǐng)專(zhuān)利,給了美國(guó)公司得以隨便開(kāi)發(fā)儀器的方便.1972年到德國(guó),77年因腦瘤過(guò)世.由于Edman降解產(chǎn)物需要在紫外域進(jìn)行檢測(cè),只有HPLC和相應(yīng)的紫外檢測(cè)手段進(jìn)步后才得到普及;60年代后期Moore&Stein利用該反應(yīng)測(cè)定了RNase的一級(jí)結(jié)構(gòu),遺憾的是Edman沒(méi)有和他們分享Nobel化學(xué)獎(jiǎng).1、肼法2、還原法3、酶降解法C端的測(cè)定方法蛋白質(zhì)與無(wú)水肼加熱

-------NH-CH-CONH-CH-COOH

|

|

Rx

Ry

--+--+NH-CH-CONH-NH2

+

NH2-CH-COOH

|

|

Rx

Ry肼(hydrazine)法測(cè)定＋NH2NH2，100℃，5～10h溶于有機(jī)溶劑而被除去多種方法確定肼法C端測(cè)定

利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)將肽鏈的氨基酸從N端

(aminopeptidase)或C端

(carboxypeptidase)一個(gè)接一個(gè)游離出來(lái)，

在不同時(shí)間取樣進(jìn)行分析，根據(jù)所游離的氨基酸的摩爾數(shù)的多少來(lái)判斷氨基酸的排列順序。酶解法末端測(cè)序酶解法末端測(cè)序肽鍵的專(zhuān)一性水解(化學(xué)法)化學(xué)法:CNBr,H+,NH2OH,etc化學(xué)法專(zhuān)一性水解消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專(zhuān)一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）泛用酶：

胰蛋白酶（trypsin）；

Lys-X,Arg-X(X≠Pro)

胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；Y-X（Y=Phe,Trp,Tyr;X≠Pro)

嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）；

木瓜蛋白酶（papain）；

X-Y(X=R,K,Q,H,Y)

胃蛋白酶（pepsin）；

枯草桿菌堿性蛋白酶（subtilisin）

專(zhuān)一酶：

Lys-X;X-Lys;Arg-X;Glu-X;X-Asp;Pro-X;Asn-X,商品名：EndoproteinaseAsn-C肽鍵的專(zhuān)一性水解(酶法)酶法專(zhuān)一性水解太短在多肽鏈中次序的決定資料：N-末端殘基H,C-末端殘基S;第一套肽段

第二套肽段OUS

SEOPS

WTOUEOVE

VERLRLA

APSHOWT

HO借助重疊肽確定肽段次序：末端殘基HS末端肽段HOWT

APS

或

OUS第一套肽段：HOWT

OUS

EOVE

RLA

PS第二套肽段：HO

WTOU

SEO

VERL

APS推斷全序列:

HOWTOUSEOVERLAPS二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化?？梢酝ㄟ^(guò)加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過(guò)甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。胰島素

-巰基乙醇碘乙酸二硫鍵的斷裂確定原多肽鏈重二硫鍵的位置：一般采用胃蛋白酶處理沒(méi)有斷開(kāi)二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過(guò)甲酸處理后，將每個(gè)肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。二硫鍵的切割與保護(hù)1、過(guò)甲酸〔performicacid〕

不可逆

－CH2SO3H2、還原＋烷基化

不可逆[巰基乙醇，DTT]

＋碘乙酸等

－S-CH2-COOH二硫鍵的保護(hù)1、為防止Cys跟Cys-Cys發(fā)生交換反應(yīng)，先將自由SH基封閉;2、進(jìn)行專(zhuān)一性部分水解;3、紙層析分離水解產(chǎn)物;4、氣相過(guò)甲酸法切斷S-S鍵，作第二相紙層析;5、將遷移率發(fā)生變化的多肽進(jìn)行測(cè)序經(jīng)典的二硫鍵位置的確定法二硫鍵位置確定對(duì)角線(xiàn)電泳示意圖現(xiàn)用蛋白質(zhì)一級(jí)

結(jié)構(gòu)分析方法分離純化蛋白質(zhì)酶切部分水解后分離短肽對(duì)短肽進(jìn)行測(cè)序構(gòu)建cDNA文庫(kù)根據(jù)序列設(shè)計(jì)探針篩選cDNA文庫(kù)根據(jù)cDNA序列推測(cè)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

N末端和C末端的測(cè)序除了用于未知蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究以外，最常用于基因工程表達(dá)產(chǎn)物的末端分析。末端測(cè)序的用途常利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)//www.espasy.ch/swissmod///////pdb/蛋白質(zhì)氨基酸順序與生物功能研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系主要是：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關(guān)系。進(jìn)行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質(zhì)氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學(xué)修飾及切割實(shí)驗(yàn)等。例1鐮刀形貧血病患者血紅細(xì)胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S）它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于β鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生了變化（Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基使血紅蛋白細(xì)胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血這說(shuō)明了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的高度統(tǒng)一性蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的個(gè)體差異例2一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活

體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)分子初合成時(shí)，常帶有抑制肽，呈無(wú)活性狀態(tài)，稱(chēng)為蛋白質(zhì)原.蛋白質(zhì)原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?例：胰島素，在剛合成時(shí)，是一個(gè)比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱(chēng)為前胰島素原前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱(chēng)為信號(hào)肽.信號(hào)肽被切去，剩下的是胰島素原。胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當(dāng)C肽被切除后才成為有51個(gè)殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.例3同源蛋白同源蛋白：是指在不同有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì).同源蛋白中的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱(chēng)為不變殘基；其他位置的氨基酸稱(chēng)可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.例：細(xì)胞色素C60個(gè)物種中，有28個(gè)位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基.可變殘基可能隨著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān)。親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進(jìn)化樹(shù)）.黃色：不變殘基（invariableresidues）藍(lán)色：保守氨基酸（conservativeresidues）未標(biāo)記：可變殘基（variableresidues）不同生物來(lái)源的細(xì)胞色素c中不變的AA殘基

細(xì)胞色素c分子的空間結(jié)構(gòu)不變的AA殘基

28個(gè)不變的AA殘基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識(shí)別”并結(jié)合細(xì)胞色素還原酶和氧化酶。1410610013432302918176759525148454138848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgGlyCysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目生物與人不同的AA數(shù)目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、豬、羊、狗11馬12雞、火雞13響尾蛇14海龜15金槍魚(yú)21角餃23小蠅25蛾31小麥35粗早鏈孢霉43酵母44

第6章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能二、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能三、血紅蛋白分子病四、免疫系統(tǒng)和免疫球蛋白五、肌球蛋白絲、肌動(dòng)蛋白絲與肌肉收縮六、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)化(Therelationbetweenstructureandfunctionofproteins)一、肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能肌紅蛋白

肌紅蛋白（myoglobin，Mb）主要存在于肌肉中，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞主要是肌細(xì)胞貯存和分配氧的蛋白質(zhì)。肌紅蛋白由一條多肽鏈和一個(gè)輔基血紅素（heme）構(gòu)成，相對(duì)分子量16700，含153個(gè)氨基酸殘基。除去血紅素后僅剩下的肽鏈部分稱(chēng)為珠蛋白（globin），它和血紅蛋白的α、β亞基有明顯的同源性，它們的構(gòu)象和功能也極為相似。血紅素非共價(jià)地結(jié)合在珠蛋白的疏水空穴中。

肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)myoglobin輔基血紅素

血紅素由原卟啉Ⅸ（protoporphyrinⅨ）中間結(jié)合一個(gè)Fe原子構(gòu)成，原卟啉Ⅸ是由4個(gè)吡咯環(huán)通過(guò)甲叉橋連接而成的扁平環(huán)狀化合物。卟啉環(huán)中央結(jié)合Fe原子，F(xiàn)e原子通常是八面體配位，應(yīng)該有6個(gè)配位鍵，其中4個(gè)配位鍵與4個(gè)吡咯環(huán)的N原子相連，另兩個(gè)配位鍵分布在卟啉環(huán)的上下。Fe原子可以是二價(jià)的或三價(jià)的，相應(yīng)的血紅素稱(chēng)為[亞鐵]血紅素（ferroheme，heme）和高鐵血紅素（ferriheme，hematin），相應(yīng)的肌紅蛋白稱(chēng)為[亞鐵]肌紅蛋白（ferromyoglobin）和高鐵肌紅蛋白（ferrimyoglobin，metmyoglobin）。

肌紅蛋白的輔基血紅素hemeprotoporphyrinⅨO2與肌紅蛋白的結(jié)合

血紅素中的鐵的第5個(gè)配位鍵與珠蛋白的第93（或F8）位His殘基的咪唑基N結(jié)合，這個(gè)His稱(chēng)為近側(cè)His，而O2與Fe的第6個(gè)配位鍵結(jié)合。在肌紅蛋白沒(méi)有結(jié)合O2時(shí)，這個(gè)部位是空的。高鐵肌紅蛋白不能與O2結(jié)合，H2O分子代替O2成為第6個(gè)配體。

在血紅素結(jié)合O2的一側(cè)，還有一個(gè)His殘基，即第64（或E7）位His殘基，稱(chēng)為遠(yuǎn)側(cè)His。由于這個(gè)遠(yuǎn)側(cè)His的存在，使得O2的結(jié)合受到空間位阻。在氧合肌紅蛋白中，O2的兩個(gè)原子與Fe不成一條直線(xiàn)，而是傾斜了30°。氧合肌紅蛋白中血紅素鐵離子的6個(gè)配體近側(cè)His遠(yuǎn)側(cè)HisCO的毒性作用

第6個(gè)配位位置的空間位阻很重要。游離在溶液中的鐵卟啉結(jié)合CO的能力比結(jié)合O2強(qiáng)25000倍，但在肌紅蛋白中，血紅素對(duì)CO的親和力僅比對(duì)O2的親和力大250倍。肌紅蛋白（還有血紅蛋白）降低對(duì)CO的親和力，可以有效地防止代謝過(guò)程中產(chǎn)生的少量CO占據(jù)它們的O2結(jié)合部位。盡管如此，當(dāng)空氣中CO的含量達(dá)到0.06%～0.08%即有中毒的危險(xiǎn)，達(dá)到0.1%則會(huì)導(dǎo)致死亡。O2和CO與肌紅蛋白血紅素Fe（Ⅱ）的結(jié)合FreehemewithimidazoleMb:COComplexOxymyoglobin肌紅蛋白的蛋白質(zhì)部分的作用

通常情況下，O2分子與Fe（Ⅱ）緊密接觸會(huì)使Fe（Ⅱ）氧化成Fe（Ⅲ），溶液中游離的亞鐵血紅素很容易被氧化成高鐵血紅素，但在肌紅蛋白中，由于血紅素處于疏水環(huán)境中，血紅素Fe（Ⅱ）不容易被氧化。同樣是血紅素，與不同的蛋白質(zhì)結(jié)合后，具有不同的功能，如在細(xì)胞色素C中，血紅素起可逆電子載體的作用，過(guò)氧化氫酶中，血紅素催化H2O2歧化成H2O和O2

。肌紅蛋白血紅素Fe原子的位移

肌紅蛋白血紅素在沒(méi)有與O2結(jié)合時(shí)，鐵原子是向第5配位體方向（HisF8）突出的。當(dāng)與O2結(jié)合時(shí)，鐵原子被拉回到卟啉平面。

肌紅蛋白血紅素Fe原子的位移肌紅蛋白結(jié)合氧的定量分析肌紅蛋白與O2結(jié)合的反應(yīng)式為其解離常數(shù)為K

,…………①令Y為肌紅蛋白的氧飽和分?jǐn)?shù)，即…………②將①改寫(xiě)為…………③肌紅蛋白結(jié)合氧的定量分析將③代入②得

，

…………④

根據(jù)henry定律，溶于液體的任一種氣體的濃度與液體上面的該氣體的分壓成正比，即

[O2]=Ap

(O2)…………⑤式中A

為比例系數(shù)，p(O2)為氧氣的分壓。

肌紅蛋白結(jié)合氧的定量分析將⑤代入④得…………⑥肌紅蛋白的氧結(jié)合曲線(xiàn)

實(shí)驗(yàn)中p(O2)可以測(cè)得，氧分壓常用Torr為單位。Y

值可用分光光度法測(cè)定，因?yàn)榧〖t蛋白結(jié)合了O2時(shí)會(huì)引起吸收光譜的改變。Y

對(duì)p(O2)作圖所得的曲線(xiàn)稱(chēng)為氧結(jié)合曲線(xiàn)。

1Torr=133Pa=1mmHg肌紅蛋白的氧結(jié)合曲線(xiàn)雙曲線(xiàn)方程Hill作圖

為氧結(jié)合肌紅蛋白的分?jǐn)?shù)與沒(méi)有結(jié)合氧的肌紅蛋白的分?jǐn)?shù)之比。兩邊取對(duì)數(shù)得

Hill作圖

以對(duì)作圖稱(chēng)為Hill作圖，肌紅蛋白的Hill圖是一條直線(xiàn)。當(dāng)時(shí)（50%的肌紅蛋白結(jié)合了氧），，這時(shí)，這一點(diǎn)的斜率稱(chēng)為Hill系數(shù)，肌紅蛋白的Hill系數(shù)等于1，說(shuō)明O2分子彼此獨(dú)立地與肌紅蛋白結(jié)合。氧與肌紅蛋白結(jié)合的Hill圖肌紅蛋白的貯氧和輸氧作用

線(xiàn)粒體中氧濃度為0～10torr，靜脈血氧濃度為15torr或更高些。肌紅蛋白的P

50為2torr，所以在大多數(shù)情況下，肌紅蛋白是高度氧合的，是氧的貯存庫(kù)。如果由于肌肉收縮使線(xiàn)粒體中氧含量下降，它就可以立即供應(yīng)氧。肌紅蛋白的貯氧和輸氧作用

肌紅蛋白也有利于細(xì)胞內(nèi)氧從細(xì)胞的內(nèi)表面向線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，因?yàn)檫@種運(yùn)轉(zhuǎn)是順濃度梯度的，細(xì)胞內(nèi)表面的氧濃度約為10torr（肌紅蛋白的氧飽和度約為80%），而線(xiàn)粒體內(nèi)的氧濃度約為1torr（肌紅蛋白的氧飽和度約為25%），肌紅蛋白可以從細(xì)胞內(nèi)表面結(jié)合氧，而運(yùn)到線(xiàn)粒體中釋放氧。二、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能血紅蛋白

血紅蛋白（hemoglobin，Hb）存在于紅細(xì)胞中，它的主要功能是在血液中結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)氧氣，它在肺中與氧氣結(jié)合，運(yùn)輸?shù)饺砀魈幗M織中，再釋放出氧氣。

人體內(nèi)有正常功能的血紅蛋白血紅蛋白的氨基酸組成

α鏈或α樣鏈由141個(gè)氨基酸殘基組成，β鏈或β樣鏈由146個(gè)氨基酸殘基組成，而肌紅蛋白的肽鏈由153個(gè)氨基酸殘基組成，它們都叫珠蛋白。同一類(lèi)型不同希臘字母代表的鏈有個(gè)別氨基酸殘基不同。血紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)β1β2α1α2Hb的α鏈、β鏈和Mb鏈構(gòu)象的相似性

血紅蛋白α鏈、β鏈及肌紅蛋白鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，但這三種肽鏈的氨基酸序列有很大不同，141個(gè)氨基酸殘基位置中只有27個(gè)位置的殘基在這三種肽鏈中是相同的。

MbHbαHbβ不同物種血紅蛋白氨基酸序列的比較

比較了多種（從七腮鰻到人）不同的血紅蛋白的氨基酸序列，證明序列中有9個(gè)位置的殘基是所有研究過(guò)的血紅蛋白所共有的，這些稱(chēng)為高度保守的殘基。血紅蛋白內(nèi)部的非極性殘基可以換成另一種非極性殘基而功能不變。

血紅蛋白氧合時(shí)亞基的移動(dòng)

血紅蛋白分子中，αβ亞基的接觸有兩類(lèi)，一類(lèi)是α1β1接觸和α2β2接觸，這類(lèi)接觸稱(chēng)為裝配接觸；另一類(lèi)是α1β2接觸和α2β1接觸，這類(lèi)接觸稱(chēng)為滑動(dòng)接觸。氧合時(shí)，每個(gè)αβ二聚體半分子作為一個(gè)剛體移動(dòng)，這兩個(gè)二聚體彼此滑動(dòng)。我們將其中一個(gè)二聚體看作不動(dòng)，另一個(gè)二聚體將繞一個(gè)設(shè)想的偏心軸旋轉(zhuǎn)15°，并平移0.08nm。血紅蛋白氧合時(shí)亞基的移動(dòng)

去氧血紅蛋白

α1β1的移動(dòng)過(guò)程氧合血紅蛋白血紅蛋白氧合時(shí)鐵原子的移動(dòng)

在去氧血紅蛋白中，鐵原子向近側(cè)His方向凸起約0.06nm。氧合時(shí)，鐵原子的體積縮小，向卟啉環(huán)平面靠近約0.039nm，并牽拉近側(cè)His往血紅素平面移動(dòng)，這些移動(dòng)，傳遞到亞基的界面，使得亞基間的相互位置發(fā)生變化。

血紅蛋白氧合時(shí)鐵原子的移動(dòng)

血紅蛋白的兩種構(gòu)象態(tài)

血紅蛋白有兩種主要構(gòu)象態(tài)，一種是T態(tài)即緊張態(tài)（tensestate），另一種是R態(tài)即松弛態(tài)（relaxedstate）。O2對(duì)R態(tài)的親和力明顯地高于對(duì)T態(tài)的親和力，并且O2的結(jié)合更穩(wěn)定了R態(tài)。缺氧時(shí)T態(tài)更加穩(wěn)定，因此T態(tài)是去氧血紅蛋白的主要構(gòu)象，R態(tài)是氧合血紅蛋白的主要構(gòu)象。T態(tài)血紅蛋白結(jié)合O2后轉(zhuǎn)變成R態(tài)，并使得分子內(nèi)一些鹽橋斷裂。

去氧血紅蛋白中各亞基間的鹽橋血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)

血紅蛋白是一個(gè)四聚體蛋白，它與肌紅蛋白相比，出現(xiàn)了一些新的性質(zhì)。血紅蛋白的氧合具有正協(xié)同同促效應(yīng)，即一個(gè)O2的結(jié)合促進(jìn)同一分子其它亞基與O2的結(jié)合。具有這種性質(zhì)的蛋白質(zhì)稱(chēng)為別構(gòu)蛋白（其它蛋白質(zhì)也有負(fù)協(xié)同效應(yīng)的）。

血紅蛋白的協(xié)同性氧結(jié)合

假設(shè)O2與Hb的結(jié)合是一種“全或無(wú)”的方式，其結(jié)合反應(yīng)式為則解離常數(shù)K

為…………⑦…………⑧

按照前面肌紅蛋白結(jié)合O2的定量分析的推導(dǎo)方法，Hb的氧飽和分?jǐn)?shù)Y

的表達(dá)式為血紅蛋白與肌紅蛋白氧合曲線(xiàn)的比較血紅蛋白的實(shí)際氧合曲線(xiàn)推導(dǎo)氧合曲線(xiàn)實(shí)際氧合曲線(xiàn)圖中的n為Hill系數(shù)血紅蛋白推導(dǎo)氧合曲線(xiàn)誤差的原因

血紅蛋白結(jié)合O2并不是“全或無(wú)”的，各個(gè)亞基結(jié)合O2是依次進(jìn)行的，并且前面亞基結(jié)合了O2對(duì)后面亞基與O2的結(jié)合有促進(jìn)作用。實(shí)際測(cè)定的n=2.8，若n=1，則無(wú)協(xié)同作用，若n>1則有正協(xié)同作用。對(duì)于血紅蛋白來(lái)說(shuō)，當(dāng)n=4時(shí)正協(xié)同作用最大，即當(dāng)1個(gè)O2與1個(gè)亞基結(jié)合后，另外3個(gè)亞基也同時(shí)與O2結(jié)合。實(shí)際情況是n=2.8。這樣，Hb對(duì)第4個(gè)O2的親和力約為與第1個(gè)O2親和力的300倍。血紅蛋白運(yùn)輸氧的效率

在肺泡中，氧分壓為100torr，工作肌肉的毛細(xì)血管中約為20torr，血紅蛋白在肺泡中Y是0.97，在肌肉毛細(xì)血管中Y是0.25，釋放的O2是兩個(gè)Y值之差，即ΔY=0.72。這個(gè)差值越大，運(yùn)輸O2的效率就越高。肌紅蛋白不能擔(dān)當(dāng)此項(xiàng)工作。

血紅蛋白別構(gòu)的異種效應(yīng)

血紅蛋白與O2的結(jié)合受其它分子的調(diào)節(jié)，如H+、CO2和2,3-二磷酸甘油酸（2,3-bisphosphateglycerate，BPG）等。雖然它們?cè)诘鞍踪|(zhì)分子上的結(jié)合部位離血紅素很遠(yuǎn)，但這些分子極大地影響Hb的氧合性質(zhì)，這是別構(gòu)效應(yīng)中的異種效應(yīng)。

2,3-二磷酸甘油酸2,3-bisphosphateglycerate，BPGBohr效應(yīng)

組織中代謝作用產(chǎn)生H+和CO2，代謝越旺盛的組織，需要的O2越多，產(chǎn)生的H+和CO2也越多。CO2在體內(nèi)被水合成碳酸。

CO2水合的結(jié)果，使組織中pH下降，即[H+]上升。O2與血紅蛋白的結(jié)合受pH和CO2濃度的影響。去氧血紅蛋白對(duì)H+的親和力比氧合血紅蛋白大。因此，增加H+濃度將促進(jìn)O2的釋放。HbO2

＋H+HbH+＋O2Bohr效應(yīng)

氧合血紅蛋白在組織中釋放的O2量除了受到組織中低O2濃度的作用外，還受組織中低pH的影響。后者叫做Bohr效應(yīng)，因1904年發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象的丹麥生理學(xué)家C.Bohr而得名。

產(chǎn)生Bohr效應(yīng)的原因是血紅蛋白中一些pK值處于7附近的可解離基團(tuán)的作用，主要是His，它們解離與否會(huì)影響到血紅蛋白的構(gòu)象，從而影響血紅蛋白對(duì)O2的親和力。Mb和在不同pH下Hb的氧合曲線(xiàn)CO2與Hb的結(jié)合

血紅蛋白還能結(jié)合CO2

，結(jié)合部位是亞基N末端游離的α－NH2。CO2的結(jié)合也能促進(jìn)O2的釋放。BPG與Hb的結(jié)合

2,3-二磷酸甘油酸（BPG）是血紅蛋白一個(gè)重要的別構(gòu)效應(yīng)劑（別構(gòu)抑制劑）。正常人紅細(xì)胞中約含有4.5mmol/L的BPG，約與血紅蛋白等摩爾數(shù)。每個(gè)Hb分子（四聚體）只有一個(gè)BPG結(jié)合位點(diǎn)，位于由4個(gè)亞基締合形成的中央孔穴內(nèi)。高負(fù)電荷的BPG分子與每個(gè)β鏈的若干個(gè)殘基的帶正電荷基團(tuán)通過(guò)靜電結(jié)合于Hb分子上，BPG把兩個(gè)β鏈交聯(lián)在一起。O2的結(jié)合使中央孔穴變小，使BPG結(jié)合變得困難。在沒(méi)有BPG存在時(shí)，O2的結(jié)合容易，而在有BPG存在時(shí)，O2的結(jié)合變得困難。BPG分子結(jié)構(gòu)及其與

Hb兩個(gè)β鏈的離子結(jié)合BPG對(duì)Hb氧合曲線(xiàn)的影響

BPG對(duì)R態(tài)Hb的親和力至少比對(duì)T態(tài)Hb低一個(gè)數(shù)量級(jí)，BPG對(duì)R態(tài)Hb的親和力大小順序?yàn)椋篐bO2

>Hb(O2)2>Hb(O2)3

，而對(duì)Hb(O2)4則完全不結(jié)合。

BPG濃度越大，Hb的氧合曲線(xiàn)就越往右偏移，說(shuō)明BPG抑制O2的結(jié)合，并增加了正協(xié)同效應(yīng)。BPG的存在可以增加Hb在組織中的卸氧量。正常情況下供給組織的氧量約為血液所能攜帶的最大氧量的40%（即ΔY=40%）。BPG對(duì)Hb氧合曲線(xiàn)的影響B(tài)PG的生理作用

人的某些生理性或病理性缺氧可以通過(guò)紅細(xì)胞中BPG濃度的升高而代償。當(dāng)正常人在短時(shí)間內(nèi)由海平面上升到4500m高的高山上時(shí)，紅細(xì)胞中的BPG濃度幾個(gè)小時(shí)后就開(kāi)始上升，兩天內(nèi)可由4.5mmol/L增加到7.5mmol/L，使氧的釋放量增大。值得注意的是，BPG濃度增加對(duì)肺中Hb與O2的結(jié)合影響不大。三、血紅蛋白分子病鐮刀狀細(xì)胞貧血病

鐮刀狀細(xì)胞貧血?。╯ickle-cellanemia）是最早被認(rèn)識(shí)的一種分子病。這種病在非洲某些地區(qū)十分流行（高達(dá)40%），它是由于遺傳基因的突變導(dǎo)致血紅蛋白分子中氨基酸殘基被改變?cè)斐傻?。鐮刀狀?xì)胞貧血病人血紅蛋白含量?jī)H為正常人（15～16g/100ml）的一半，紅細(xì)胞數(shù)目也是正常人（4.6～6.2×106個(gè)/ml）的一半左右，而且紅細(xì)胞的形態(tài)也不正常，除了有非常大量的未成熟紅細(xì)胞外，還有很多成鐮刀狀的紅細(xì)胞。當(dāng)紅細(xì)胞脫氧時(shí)，鐮刀狀紅細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。這種病人的血紅蛋白稱(chēng)為HbS。

正常紅細(xì)胞與鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病人的紅細(xì)胞比較鐮刀狀細(xì)胞貧血病

鐮刀狀細(xì)胞貧血病是一種致死性疾病，它的純合子患者有的在童年就死亡。雜合子患者的壽命也不長(zhǎng)，但它能抵抗一種流行于非洲的瘧疾。這種瘧疾也是一種致死性疾病，甚至具有正常血紅蛋白的人死于這種瘧疾的比例也很高，常常在還沒(méi)有繁殖后代就已死去。Hbs雜合子患者對(duì)這種瘧疾有一定的抵抗能力，尚能繁殖后代，這是因?yàn)殡s合子患者加速被感染紅細(xì)胞的破壞而中斷瘧原蟲(chóng)的生活周期的緣故。HbA和HbS的胰蛋白酶消化液的指紋圖譜（先垂直方向?yàn)V紙層析，后水平方向電泳）HbAHbSHbA和HbS氨基酸序列的比較HbAH2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys……C端HbSH2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val

-Glu-Lys……C端

（β鏈）12345678（示差異處）HbS聚集成纖維狀沉淀

β6殘基位于分子表面，當(dāng)Val取代了Glu后，在分子的表面多了一個(gè)疏水基團(tuán)。血紅蛋白的氧合性質(zhì)和別構(gòu)性質(zhì)不受此變化的影響，但這一變化顯著影響了血紅蛋白的溶解度。在去氧血紅蛋白分子表面的另一處有一個(gè)疏水性口袋，正好能與這個(gè)Val側(cè)鏈結(jié)合，它們可以互相聚集成纖維狀沉淀。氧合血紅蛋白表面沒(méi)有這個(gè)疏水性口袋，所以只有在缺氧時(shí)，紅細(xì)胞才會(huì)成為鐮刀狀。

HbS聚集成纖維狀

兩股HbS鏈連鎖在一起14股鏈纖維地中海貧血

地中海貧血可以由幾條途徑產(chǎn)生：①缺失一個(gè)或多個(gè)編碼血紅蛋白鏈的基因；②所有基因都存在，但一個(gè)或