分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義示例

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義示例分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義示例CTAB法提取植物基因組DNA【實(shí)驗(yàn)背景】高等動物，高等植物的基因組相當(dāng)龐大，一些物種的特定基因組包括了該物種生長，發(fā)育，繁殖等各項(xiàng)生理活動的幾乎全部信息量，因而對真核細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)，組成，以及表達(dá)調(diào)控的研究是至關(guān)重要的，而提取要求是獲得純度高和收得率高?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、掌握植物材料基因組DNA的CTAB法提取分離基本原理的方法；2、掌握微量移液槍、液氮研磨、微量試管、高速離心機(jī)等使用操作技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】植物組織采用液氮研磨達(dá)到細(xì)胞破碎，細(xì)胞內(nèi)容物采用CTAB分離蛋白質(zhì)、多糖，再有苯酚、氯仿、異戊醇混合液萃取純化，RNA由RNA酶消化，分離出的DNA由無水乙醇沉淀分離【材料儀器】材料：幼嫩的植物材料1.0g左右（紅葉石楠）儀器：移液槍、電子天平、恒溫水浴箱、高速離心機(jī)、EP管、液氮、研磨等?！緦?shí)驗(yàn)試劑】抽提緩沖液（2×CTAB溶液）：2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、20mmol/LEDTA、1.4mol∕LNaCL、1%β-巰基乙醇、0.1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、100mmol∕LTriS-HCl（pH=8.0）TE:10MmTris-HCl（pH=8.0），1mMEDTA其他試劑：液氮、RNA酶、氯仿、異戊醇、CTAB、無水乙醇、苯酚、EDTA等【實(shí)驗(yàn)操作】取1.0g植物材料，雙蒸水洗凈，并用濾紙吸干植物材料剪成0.5cm左右碎片，放入預(yù)冷的瓷研磨中。加入液氮速冷，研磨成細(xì)粉（越細(xì)越好）。轉(zhuǎn)入加有抽提緩沖液3.0ml的5ml離心管60℃水浴保溫1小時（不時轉(zhuǎn)動試管）分裝成2個2,mlEP管，15,000rpm,離心10分鐘取上清轉(zhuǎn)入另一個新的離心管，加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），混合均勻抽提至水乳膠融狀。15,000rpm離心5分鐘上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入0.8-1.0倍體積預(yù)冷異戊醇，-20C。保溫30分鐘一1小時，緩緩混勻DNA成絮狀折出15,000rpm,離心5分鐘，棄上清DNA沉淀用冰冷的70%乙醇洗2次揮發(fā)盡乙醇后，用200μlTE緩沖液溶解DNA,-20℃凍存?！咀⒁馐马?xiàng)】1、使用新鮮、幼嫩的材料，材料應(yīng)適量。2、如果樣品容易呈粘稠狀，可能含有較多的多糖。3、如果樣品溶液呈棕色，可能含有較多的.酚類物質(zhì)。4、操作過程中避免劇烈振蕩，器件、器皿和試劑需要高溫滅菌?！舅伎碱}】1、為什么要用新鮮、幼嫩的植物組織材料？2、為什么在操作過程中避免劇烈振蕩？3、為什么器件、器皿和試劑需要高溫滅菌？4、如何提高提取植物組織DNA的產(chǎn)量？苯酚：作為蛋白變性劑同時抑制了DNaSe的降解作用.用苯酚處理勻漿液時由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿：也可使蛋白質(zhì)變性并加速有機(jī)相與液相分層。異戊醇：有助于消除抽提過程中產(chǎn)生的氣泡。CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium匕「。^^巳十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑,具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(0.7mol∕LNa