蛋白質(zhì)的分離純化2

邱曉挺qiuxiaoting@高級生物化學(xué)

——蛋白質(zhì)的分離純化（II）4.2凝膠過濾層析

（Gelfiltration；GF）

GFisasimpleandreliablechromatographicmethodforseparatingmoleculesaccordingtosize分子篩Scanningelectronmicrographofanagarosegel.Magnificationx50,000

AndersS.Medin,PhDThesis,UppsalaUniversity1995.

凝膠過濾色譜介質(zhì)是由直徑大小為0.1mm的不溶于水的,親水的,惰性的顆粒(Beads)組成.Thebeadsarecomposedof

dextranpolymers(sephadex),

agarose(Sepharose瑞典，Bio-gelA美國，segavac英國)

polyacrylamide(SephacrylorBioGelP)etc.基于大小不同的蛋白從限定大小顆粒內(nèi)徑的層析柱中進(jìn)行洗脫體積(或流速一定時(shí)的洗脫時(shí)間)的差別。分離也與蛋白的形狀有關(guān)。蛋白越小,在柱中的保留時(shí)間越長,洗脫體積越大,洗脫時(shí)間越長。對于蛋白的聚集敏感.。凝膠過濾色譜的原理

凝膠過濾色譜的基本術(shù)語Vt=總體積Vo=外體積,孔隙體積,外水體積Vi=內(nèi)體積,內(nèi)水體積Vg=凝膠本身的體積Vt=Vi+Vg+VoVe=洗脫體積(elutionvolume)，指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積.

Kav=分配系數(shù)

(PartitionCoefficient)

一組分在固定相與流動(dòng)相中含量的比值－－分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系，表示排阻程度Kav

＝(Ve-Vo)/ViKav=0,Ve＝Vo，全排阻。Kav=1,Ve=Vo+Vi,全進(jìn)入。0<Kav<1,部分進(jìn)入。Kav>1,吸附作用。Vt=總體積Vo=外水體積Vi=內(nèi)水體積Thethreecategoriesofaccessiblevolumesareusedfordifferentpurposes.MoleculeswithpartialaccesstotheporeswillberetardedinrelationtotheirrespectivedegreeofaccesstotheporesMoleculeswithfullaccesstothepores

willallmovedownthecolumnatthesamespeedandremainunseparatedfromeachother.1.Equilibration.

Thecolumnisequilibratedwiththebufferintendedfortheseparation.Procedure:2.Sampleapplication.

Thesampleisaddedasasharpnarrowzoneatthetopofthecolumn.Forgoodresolutionthesamplevolumeshouldberestrictedto0.5-5%ofthecolumnvolume3.Elution.

Elutionbuffer(normallythesametypebufferasthatusedforequilibration)ispumpedthroughthecolumntomakethesamplecomponentsseparatebycontinuousre-partitioning.CharacterizationofgelfiltrationmediaTheselectivityofagelfiltrationmediumdependsonitsporesizedistribution

aselectivitycurveisused

FractionationrangesforSuperdexandSephacrylgelfiltrationmedia.

Thesteeperthecurve,thehighertheresolutionKavMr凝膠過濾層析操作中的注意點(diǎn)上樣體積要足夠的?。ㄒ话銥檎麄€(gè)柱體積的0.5％～5％）?？刂屏魉伲乐惯^壓。樣品中可含一定的鹽分。洗脫一般為無梯度的洗脫。4.3親和色譜Affinitychromatography(AC)ACenablingpurificationofabiomoleculewithrespecttobiologicalfunctionorindividualchemicalstructure.親和層析是以蛋白質(zhì)與結(jié)合在介質(zhì)上的配基間的特異親和力為工作基礎(chǔ)。配基可以是生物學(xué)特異的，如底物、抗體、抑制劑、輔酶及蛋白質(zhì)（如抗原、抗體）、核酸。也可以是具有相對特異相互作用的凝集素（糖結(jié)合蛋白）、染料和疏水分子(亦可歸屬疏水相互作用色譜)。親和層析是應(yīng)用了特定蛋白的生物學(xué)特異性而不是物化特性。具有親和選擇性強(qiáng)，純化效率高，可以一步純化。ACreliesuponareversiblehighlyspecificbindingreactionL+TLT直接親和層析親和色譜需要一個(gè)特定的配基,此配基能共價(jià)結(jié)合于支持物而不改變其結(jié)合力.

最有效的配基是具有解離常數(shù)為

M-mM

范圍內(nèi)結(jié)合蛋白的那類..

此外必需有一個(gè)可溶性的配體形式,其能有效的競爭結(jié)合.最好結(jié)合能被調(diào)節(jié).連接配基到支持物上挑選的支持物必須有適于偶聯(lián),不能單獨(dú)與蛋白反應(yīng).伴刀豆球蛋白Aspacerissometimesusedtoensurefullaccessibilityoftheaffinityligand連接者手臂(Arms)連接者手臂可以延伸配基使其遠(yuǎn)離介質(zhì)表面,從而消除配基結(jié)合蛋白表面的立體限制.經(jīng)常優(yōu)選相對短(uptoC6-C8)的連接者手臂,因?yàn)檩^長的碳鏈其本身也會(huì)產(chǎn)生立體干擾,且會(huì)提供疏水表面從而會(huì)發(fā)生非特異性的結(jié)合.Suitableconditionsforbinding/elution

findaligandspecificenough,butwithabindingstrengththatallowssafeelution

Noleakageduringsampleapplicationandwash.Targetmoleculeelutesasanarrowpeak與基因工程技術(shù)相結(jié)合的親和層析

Affinitychromatographyappliedtorecombinantproteins

是基因工程技術(shù)，蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)與色譜技術(shù)的結(jié)合（也可直接用于純化特定的金屬蛋白結(jié)合）.理論上其可以純化所有的蛋白，故廣泛應(yīng)用于高通量蛋白質(zhì)的純化。重組技術(shù)拓寬了親和色譜的選擇蛋白有能力附上特異的序列片斷,以及特異金屬螯合的支持物的發(fā)展已經(jīng)提供了一個(gè)新的途徑.

His6(HHHHHH)為最普遍應(yīng)用的tag,從而使蛋白的純化在固定金屬親和柱上進(jìn)行.His6tag既可置于N-端也可置于C-端以助于純化HisHisHisHisHisthrombinthrombinproteinproteinproteinproteinproteinTEVTEVSXa表達(dá)構(gòu)建選擇XapET15bpET30LICMCSG3pRroEX(ENLYFQ

G)MCSG7(ENLYFQ

S)Tagcleavageefficiencyproteasetimehrt

Csuccessrate,%specificitythrombin16-2425-37

~90-/+factorXa16-60

25-37~60+/-rTEV1-34-30

~95+Affinitytag

smalleasytoremove(protease)Proteasespecificityfastcheaptaggedtobaccoetchvirus(TEV)protease

Productionandpurificationoffusionproteins重組技術(shù)拓寬了親和色譜的選擇

金屬親和色譜使得從細(xì)胞裂解液中得到的His6-tag蛋白的快速分離稱為可能.一般的,固定化金屬離子親合色譜柱既能在天然狀態(tài)下也能在變性(6M鹽酸胍)條件下操作.interactionAisweaknobindingofthe6xHis-taggedproteins.interactionAisstrong,butinteractionBweak,proteinislostasprotein–metalcomplexesduringwashsteps.WhenNTAligandandnickelareusedtobind6xHis-taggedmolecules,bothinteractionsarestronger.蛋白洗脫結(jié)合的重組蛋白可以用改變pH值的方法可以用提高咪唑濃度的方法來洗脫.SDSanalysis(Coomassiestain)oftheindicatedfractions.CL:clearedlysate(5μl);FT:flowthrough(5μl);W:wash(5μl);E1–E6:elutionfractions(1μl).M:marker(sizesasindicatedontheleft[kDa]).Schematicoverviewof(His)6fusionproteinpurificationusingHiTrap?ChelatingHP其它用基因工程技術(shù)所采用的親和層析技術(shù)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GlutathioneS-transferase，GST）親和層析法硫氧還蛋白(TRX)親和層析法麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)親和層析法…谷胱甘肽柱目的:純化GSTorGST融合蛋白谷胱甘肽

3a.a.肽(Glu-Cys-Gly)GST對其有親和力GSHGSSGSchematicoverviewofGSTfusionproteinpurificationusingGSTrap?His-tags融合蛋白往往溶解性差，蛋白折疊不正確，易形成包涵體。但較為穩(wěn)定GST-融合蛋白往往溶解性較好，可能對蛋白的正確折疊有一定的貢獻(xiàn)。但是易降解。不同的表達(dá)標(biāo)簽會(huì)對蛋白

產(chǎn)生不同的效應(yīng)4.4反相色譜(Reversed-PhaseChromatography；HPC）——purificationandseparationofbiomoleculesbasedondifferencesintheirsurfacehydrophobicity.REVERSEDPHASESEPARATIONPRINCIPLENonpolar(nonspecific)interactionsofanalytewithhydrophobicadsorbentsurface烷基硅烷(-C18,C8,C4)Differentsorptionaffinities

（吸附力）betweenanalytesresultsintheirseparationMorepolaranalytesretainedlessAnalyteswithlargerhydrophobicpartareretainedlongerAlmostnoseparationofstructuralisomersReversedphasechromatography

moleculesofinterestcanbeboundwhilecontaminantspassthroughor

c