第六章-真核生物基因表達調(diào)控

第六章真核生物的基因表達調(diào)控學習目的和要求1、了解基因家族的概念；2、掌握真核基因表達與調(diào)控的一般規(guī)律與特點；3、掌握真核生物基因表達調(diào)控在不同表達階段的具體作用特征；4、重要順式作用元件與反式作用因子的基本概念、作用特征及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特點；5、掌握轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)的主要方式。（教材P.280-337）第一節(jié) 概述基因表達調(diào)控最明顯的特征是能在特定時間和特定的細胞中激活特定的基因，從而實現(xiàn)“預(yù)定”的、有序的、不可逆的分化和發(fā)育過程，并使生物的組織和器官在一定的環(huán)境條件范圍內(nèi)保持正常的生理功能。（教材P.280-282）真核生物基因表達調(diào)控瞬時調(diào)控或可逆調(diào)控相當于原核生物對環(huán)境條件變化所做出的反應(yīng)。瞬時調(diào)控包括某種代謝底物濃度或激素水平升降時，或細胞周期在不同階段中酶活性和濃度的調(diào)節(jié)。發(fā)育調(diào)節(jié)或不可逆調(diào)控真核生物基因表達調(diào)控的精髓，它決定了真核生物細胞分化、生長和發(fā)育的全過程。據(jù)基因調(diào)控在同一事件中發(fā)生的先后次序，又可將其分為：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控（transcriptionalregulation）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控（posttranscriptionalregulation）翻譯水平調(diào)控（translationalregulation）蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控（regulationofproteinmaturation）研究基因調(diào)控應(yīng)回答下面三個主要問題：①什么是誘發(fā)基因轉(zhuǎn)錄的信號？②基因調(diào)控主要是在那個環(huán)節(jié)（模板DNA轉(zhuǎn)錄，mRNA的成熟或蛋白質(zhì)合成）實現(xiàn)的？③不同水平基因調(diào)控的分子機制是什么？一、真核基因組的復(fù)雜性1.基因組大；2.染色質(zhì)在核膜內(nèi)；3.基因組是二倍體或多倍體；4.沒有操縱子結(jié)構(gòu)；5.基因組中僅約10%的序列為蛋白質(zhì)、rRNA、tRNA等編碼，其余約90%的序列功能至今還不清楚。6.有外顯子（exon）和內(nèi)含子（intron）；7.存在大量重復(fù)序列；8.基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)相對較大；9.真核生物的RNA在細胞核中合成，只有經(jīng)轉(zhuǎn)運穿過核膜，到達細胞質(zhì)后，才能被翻譯成蛋白質(zhì)。二、真核基因表達調(diào)控的特點（一）真核基因表達調(diào)控的環(huán)節(jié)更多；（二）真核基因的轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)；（三）真核基因表達以正性調(diào)控為主。三、基因家族真核細胞中許多相關(guān)的基因常按功能成套組合，被稱為基因家族（genefamily）。1、簡單多基因家族----基因一般以串聯(lián)方式前后相連（教材P.282-286）2、復(fù)雜多基因家族一般由幾個相關(guān)基因家族構(gòu)成，基因家族之間由間隔序列隔開，并作為獨立的轉(zhuǎn)錄單位。3、發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜多基因家族第二節(jié) 真核生物DNA水平上的基因表達調(diào)控一、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對真核基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控1.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄常染色質(zhì)中的基因可以轉(zhuǎn)錄異染色質(zhì)(heterochromatin)無基因轉(zhuǎn)錄表達。2.組蛋白的作用組蛋白扮演了非特異性阻遏蛋白的作用非組蛋白成分起到特異性的去阻遏促轉(zhuǎn)錄作用核小體結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄。（教材P.288-296）二、基因擴增對基因表達的影響基因擴增（geneamplification）是指在沒有發(fā)生細胞分裂，整條染色體幾乎沒有復(fù)制的情況下，細胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性增加的現(xiàn)象。它使細胞在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的基因產(chǎn)物以滿足生長發(fā)育的需要，是基因活性調(diào)控的一種方式。1、為滿足正常的生長發(fā)育需要如兩棲類和昆蟲卵母細胞rRNA基因的擴增:卵母細胞中的rDNA拷貝數(shù)比體細胞中增加了4000倍。在果蠅濾泡細胞中，編碼卵殼蛋白的卵殼基因的擴增。2、外界環(huán)境因素引起基因擴增基因擴增與腫瘤形成及細胞衰老有關(guān)。在原發(fā)性的視網(wǎng)膜細胞瘤中，含myc原癌基因的DNA區(qū)段擴增10-200倍。許多致癌劑可誘導DNA擴增。

三、基因重排對基因表達的影響將一個基因從遠離啟動子的地方移到距它很近的位點從而啟動轉(zhuǎn)錄，這種方式被稱為基因重排。（教材P.290-292）四、DNA甲基化與基因活性的調(diào)控真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,m5C)，而活躍轉(zhuǎn)錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。甲基化可使基因失活，去甲基化又可使基因恢復(fù)活性。HpaⅡHpaⅡ只能切非甲基化的CCGG，所以只有一個切點，產(chǎn)生兩條帶；MspⅠ可以切甲基化和未甲基化的CCGG，因此有兩個切點，產(chǎn)生3條電泳帶。（教材P.292-296）五、基因丟失在細胞分化過程中，通過丟掉某些基因而去除其活性。例如某些原生動物，線蟲、昆蟲、甲殼類動物，體細胞常丟掉部分或整條染色體，只保留將來分化產(chǎn)生生殖細胞的那套染色體。例如在蛔蟲胚胎發(fā)育過程中，有27％DNA丟失。在高等動植物中，尚未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。許多生物各類不同的細胞或細胞核都具有全能性totipotency。第三節(jié) 真核基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控一、順式作用元件（cisactingelements）（一）啟動子(1)核心啟動子成分，如TATA框；(2)上游啟動子成分（UPE），如CAAT框，GC框，八聚體（octamet）ATF結(jié)合位點；(3)遠上游順序（UAS）：如增強子，酵母中的UAS（upstreamactivatorseguences）減弱子、靜息子等。(4)特殊細胞中的啟動子成分：如淋巴細胞中的Oct（octamer）和κB。（教材P.296-328）表6-1哺乳動物RNA聚合酶Ⅱ啟動子上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的序列元件組件保守順序DNA長度結(jié)合因子大?。―a）豐度（/細胞）分布TATAboxTATAAAA～10bpTBP27,000?普遍CAATboxGGCCAATCT～22bpCTF/NF160,000300,000普遍GCboxGGGCGG～20bpSP1165,00060,000普遍OctamerATTTGCAT～20bpOct-176,000?普遍OctamerATTTGCAT

23bpOct-252,000?淋巴細胞κBGGGACTTTCC～10bpNFκB44,000?淋巴細胞κBGGGACTTTCC～10bpH2·TH1??普遍ATFGTGACGT～20bpATF??普遍B.Lewin:《GENES》Ⅴ.1994,table29.3（二）增強子（Enhancer）

1981年Benerji,Rusconi和Chambom等發(fā)現(xiàn)，又稱遠上游序列（farupstreamseguence）。最早SV40病毒中發(fā)現(xiàn)長約200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍。

100-200bp長度，由若干組件構(gòu)成，其基本核心組件常為8-12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。增強子：在真核細胞中通過啟動子來增強轉(zhuǎn)錄的一種遠端遺傳性控制元件。（教材P.298-299）增強子的特性：②功能與位置和方向無關(guān)，能遠距離發(fā)揮作用

①增強效應(yīng)十分明顯；④組織或細胞特異性③大多為重復(fù)序列；⑤不具有啟動子專一性⑥受外部信號的調(diào)控（三）沉默子（silencer）負性調(diào)控元件，它與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄。最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，以后在T淋巴細胞的T抗原受體基因的轉(zhuǎn)錄和重排中證實其存在。沉默子的作用特點：不受序列方向的影響，能遠距離發(fā)揮作用，并可對異源基因的表達起作用。（四）上游激活序列（upstreamactivatingseguences，UASs）類似于增強子。作用：影響轉(zhuǎn)錄程度，對位點選擇不起作用。有方向性，不能在啟動子的下游起作用。結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子是GCN4和GAL4，識別位點為ATGACTCAT。（五）效應(yīng)元件（responseelement）一組受到共同調(diào)控的基因，都有一個相同的元件（序列），此元件能與某一個(類)專一蛋白結(jié)合，使基因?qū)ζ渥鞒龇磻?yīng)。特點：有短的保守順序；是啟動子或增強子的上游元件。在不同基因中，拷貝相似，有時有多個拷貝；與轉(zhuǎn)錄起點距離不固定。表真核生物的效應(yīng)元件調(diào)節(jié)劑元件保守順序DNA長度因子大?。―a）熱休克HSECNNGAANNTCCNNG27bpHSTF93,000糖皮質(zhì)激素GRETGGTACAAATGTTCT20bp受體94,000弗波酯TRETGACTCA22bpAP139,000血清SRECCATATTAGG20bpSRF52,000（六）絕緣子（insulator）能阻斷激活或失活效應(yīng)通過的元件。特性：在增強子和啟動子之間，阻斷增強子對啟動子的激活作用在活性基因和異染色質(zhì)之間，能保護基因被異染色質(zhì)延伸帶來的失活效應(yīng)二、反式作用因子（transactingfactors）反式作用因子：能調(diào)節(jié)與它們接觸的基因的表達的各種擴散分子（通常是蛋白質(zhì)），如轉(zhuǎn)錄因子；其編碼基因與其識別或結(jié)合的靶核苷酸序列不在同一個DNA分子上。轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor)是起正調(diào)控作用的反式作用因子。轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄起始過程中RNA聚合酶所需的輔助因子。真核生物基因在無轉(zhuǎn)錄因子時處于不表達狀態(tài)，RNA聚合酶自身無法啟動基因轉(zhuǎn)錄。

（一）反式作用因子分類和作用方式1、分類①通用反式作用因子，在一般細胞中普遍存在，主要識別一些啟動子的核心啟動成分TATA框，如TBP；上游啟動子成分CAAT框，如CTF/NF-1；GC框如SP1；識別八聚體核苷酸Oct-1等；②特異反式作用因子：特殊組織與細胞中的，如淋巴細胞中的Oct-2；③誘導型因子：和反應(yīng)性元件（responseelements）相結(jié)合的反式作用因子。2、調(diào)控方式蛋白質(zhì)和DNA相互作用蛋白質(zhì)和配體結(jié)合蛋白質(zhì)之間的相互作用蛋白質(zhì)的修飾。（二）轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征

DNAbindingdomain，BD：<100aa，氫鍵，大溝

transcriptionactivedomain，AD：30-100aaregulardomain：與其它因子或調(diào)控蛋白結(jié)合不與DNA直接結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子沒有DNA結(jié)合域，通過轉(zhuǎn)錄激活域直接或間接作用與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體而影響轉(zhuǎn)錄效率。（三）反式作用因子中的DNA識別或結(jié)合域與DNA結(jié)合的功能域常見以下幾種結(jié)構(gòu)花式/基元：鋅指（Zincfingerregion）螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)（helix-turn-helix，HTH）；螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)（helix-loop-helix，HLH）：亮氨酸“拉鏈”式二聚體（leucinezipper）；motif（基序，基元，花式）：構(gòu)成任何一種特征序列或結(jié)構(gòu)的基本單位，是超二級結(jié)構(gòu)。1、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix,HTH）至少有兩個α螺旋，其間由短肽段形成的β轉(zhuǎn)角連接；二聚體形式存在；距離正好相當于DNA一個螺距（3.4nm），兩個α螺旋剛好分別嵌入DNA的深溝。

（教材P.300-301）LacO的R蛋白λ阻遏蛋白與cro蛋白λCAP酵母接合型調(diào)控蛋白α1，α2玉米的Kn1水稻的OSH1許多調(diào)控蛋白都有HTH2、鋅指（zincfinger）

Zn2+與4個Cys

、或2個Cys和2個His相結(jié)合。整個蛋白質(zhì)分子有2-9個鋅指重復(fù)單位。每一個單位的指部伸入DNA雙螺旋的深溝，接觸5個核苷酸。（教材P.301-303）（1）I型鋅指：2Cys/2His

~23aa

Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His

Cys，His與Zn2+結(jié)合形成4面體結(jié)構(gòu)，使中部的氨基酸回折成環(huán)，凸出如手指中部芳香族氨基酸保守，疏水串聯(lián)重復(fù)排列，兩指間7-8aa

鋅指數(shù)目多少不等與GC盒結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子SP1中有連續(xù)的3個鋅指重復(fù)結(jié)構(gòu)。SP1TFIIIA344aa，N端與DNA結(jié)合9個鋅指，每個～30aa與5srRNA基因內(nèi)啟動子（50bp)結(jié)合（2）Ⅱ型鋅指：4Cys保守序列為：

Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-CysZn2+與4個Cys結(jié)合

DNA結(jié)合序列較短，對稱無大量重復(fù)性鋅指

Cys2/Cys2與Cys2/His2不同例如GAL4，酵母的轉(zhuǎn)錄因子，哺乳類的固醇類激素受體糖皮質(zhì)激素特異性雌激素特異性類固醇激素受體是以二聚體形式發(fā)揮其促進轉(zhuǎn)錄作用的。它們的兩個鋅指的功能不同。第1個鋅指的右側(cè)是控制與DNA結(jié)合的，第2個鋅指的左側(cè)則是控制形成二聚體的能力的。3、同源域（Homeodomain）最早在果蠅的homeoticloci（決定身體結(jié)構(gòu)）中發(fā)現(xiàn)同形異位現(xiàn)象(homeosis):

果蠅頭部長觸角部位長出腳來。 同形異位盒基因(homeobox):高度保守的一段核苷酸序列（180bp）,控制胚胎發(fā)育的基因。從酵母到人類都存在；

homeobox,DNA序列高度保守。（教材P.304-305）

Homeodomain有3個—helix,H1與H2平行H2與H3形成HTHmotifH3位于大溝中，與DNA特異結(jié)合N末端位于小溝中，與DNA接觸

HD與HTH的不同：（1）HD的C端由3個α-螺旋構(gòu)成，螺旋3結(jié)合于大溝；而HTH至少2個α-螺旋構(gòu)成；（2）HTH以二聚體形式與DNA結(jié)合，而HD是以單體形式與DNA結(jié)合。-COOH，每隔6個氨基酸出現(xiàn)一個Leu，所有Leu出現(xiàn)在同一側(cè)面，成直線排列，形成疏水面依靠Leu的疏水作用，2個helix相互纏繞，形成拉鏈結(jié)構(gòu)-NH2,富含堿性氨基酸，螺旋狀，＋，堿性DNA結(jié)合域，與DNA雙螺旋鏈上帶負電荷的磷酸基團結(jié)合4、堿性－亮氨酸拉鏈（basicleucinezipper,bZIP）（教材P.303-304）5、堿性螺旋--環(huán)--螺旋（basichelix-loop-helix）

40～50aa

含2個

-helix（15~16aa）,由連接區(qū)（12~28aa）連接；兩親性,amphipathic；通過疏水面作用形成二聚體；－NH2端為堿性結(jié)合區(qū)，16aa，其中6aa為保守序列。（教材P.304）缺乏堿性區(qū)的蛋白質(zhì)，即使形成（同、異）二聚體，也無法同DNA結(jié)合（四）蛋白質(zhì)和配體的結(jié)合甾類受體蛋白有3個不同的功能區(qū)：（1）N-端區(qū)是激活轉(zhuǎn)錄所需的區(qū)域，不同受體之間此區(qū)的同一性僅小于15%；（2）DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，同一性較高為94-42%；（3）C-端的激素結(jié)合和二聚體形成區(qū)，同一性為57-15%。

糖皮質(zhì)激素對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控激素-受體復(fù)合物進入細胞核，與增強子結(jié)合從而激活啟動子，開始轉(zhuǎn)錄。糖皮質(zhì)激素進入細胞，與受體結(jié)合；（五）DNA結(jié)合蛋白主要轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcriptionactivationdomains）一般由20-100個氨基酸殘基組成。如GAL4分子中有2個這種結(jié)構(gòu)域，分別位于多肽鏈的第147-196位和第768-881位；GCN4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域位于多肽鏈的第106-125位。（教材P.305-306）1、酸性α-螺旋（acidicα-helix）（A區(qū)）

該結(jié)構(gòu)域含有由酸性氨基酸殘基組成的保守序列，多呈帶負電荷的親脂性α-螺旋，包含這種結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子有GAL4、GCN4、糖皮質(zhì)激素受體和AP-1/Jun等。增加激活區(qū)的負電荷數(shù)能提高激活轉(zhuǎn)錄的水平?？赡苁峭ㄟ^非特異性的相互作用與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上的TFIID等因子結(jié)合生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物而促進轉(zhuǎn)錄。2、谷氨酰胺豐富區(qū)(glutamine-richdomain)（P區(qū)）SP1的N末端含有2個主要的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，氨基酸組成中有25%的谷氨酰胺，很少有帶電荷的氨基酸殘基。酵母的HAP1、HAP2和GAL2及哺乳動物的OCT-1、OCT-2、Jun、AP2和SRF也含有這種結(jié)構(gòu)域。

3、脯氨酸豐富區(qū)(proline-richdomain)

（Q區(qū)）CTF家族（包括CTF-1、CTF-2、CTF-3）的C末端與其轉(zhuǎn)錄激活功能有關(guān)，含有20%-30%的脯氨酸殘基。（六）蛋白質(zhì)之間的相互作用

酵母半乳糖代謝中GAL80和GAL4的相互作用就是很好的例