微生物的實驗室培養(yǎng)

課題1微生物的實驗室培養(yǎng)專題2微生物的培養(yǎng)與應用背景知識19世紀中期，關系到法國經濟命脈的釀酒業(yè)曾一度遭受毀滅性的打擊。在生產過程中，出現(xiàn)了葡萄酒變酸、變味的怪事。經過一番研究，法國科學家巴斯德發(fā)現(xiàn)，導致生產失敗的根源在于發(fā)酵物中混入了雜菌。由此人們認識到保持培養(yǎng)物純凈的重要性。防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物，是研究和應用微生物的前提。在實驗室培養(yǎng)微生物，一方面需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，另一方面需要確保無處不在的其他微生物無法混入。一、基礎知識（一）培養(yǎng)基閱讀教材“培養(yǎng)基”，思考以下問題：1、什么是培養(yǎng)基？2、什么是液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基？3、瓊脂有何特點？4、你還知道有哪些類型的培養(yǎng)基？5、培養(yǎng)基含有哪些基本成分？為什么？自養(yǎng)形微生物和異養(yǎng)型微生物的碳源分別是什么？6、培養(yǎng)基在含有基本成分外，還需滿足哪些條件？1、什么是培養(yǎng)基？人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質，叫培養(yǎng)基。2、什么是液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基？呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基叫液體培養(yǎng)基，呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基叫固體培養(yǎng)基。3、瓊脂有何特點？瓊脂是一種從紅藻中提取的多糖。瓊脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常規(guī)培養(yǎng)條件下呈固體狀態(tài)。液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等。（2）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。4、你還知道有哪些類型的培養(yǎng)基？

5、培養(yǎng)基含有哪些基本成分？為什么？自養(yǎng)形微生物和異養(yǎng)型微生物的碳源分別是什么？

培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽。

因為組成細胞的主要元素是C、H、O、N、P、S等。

自養(yǎng)型微生物的碳源是無機碳，異養(yǎng)型微生物的碳源是有機碳。6、培養(yǎng)基在含有基本成分外，還需滿足哪些條件？還需要滿足微生物生長對PH、特殊營養(yǎng)物質以及氧氣的要求。（二）無菌技術閱讀教材“無菌技術”，思考以下問題：1、獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是什么？2、從哪些方面著手解決雜菌污染問題？3、無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？4、消毒和滅菌有何區(qū)別？5、消毒的方法有哪些？6、滅菌的方法有哪些？7、在實驗室能否吃東西、喝水？1、獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是什么？關鍵是防止外來雜菌的入侵。2、從哪些方面著手解決雜菌污染問題？①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。④實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。3、無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。4、消毒和滅菌有何區(qū)別？消毒是指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。滅菌是指使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。5、消毒的方法有哪些？①煮沸消毒法：在100℃煮沸5~6分鐘可以殺死微生物的營養(yǎng)細胞和一部分芽孢。②巴氏消毒法：對于一些不耐高溫的液體，如牛奶，則使用巴氏消毒法，在70~75℃煮30分鐘或在80℃煮15分鐘，可以殺死牛奶中的微生物，并使牛奶的營養(yǎng)成分不被破壞。③紫外線消毒。④化學藥劑消毒：如用75%的酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。6、滅菌的方法有哪些？①灼燒滅菌：②干熱滅菌：將滅菌物品（能耐高溫的、需要保持干燥的物品）放入干熱滅菌箱內，在160~170℃加熱1~2小時可達到滅菌的目的。干熱滅菌的操作方法③高壓蒸汽滅菌：壓力為100Pa，溫度為121℃，時間15~30分鐘。高壓滅菌的操作方法判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如需要請選擇合適的方法。1、培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿。2、玻棒、試管、燒瓶和吸管。3、實驗操作者的雙手。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。7、在實驗室能否吃東西、喝水？在實驗室中，切不可吃東西、喝水，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染，使用后的培養(yǎng)基丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環(huán)境。二、實驗操作本實驗用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行大腸桿菌的純化培養(yǎng)，可分成制備培養(yǎng)基和純化大腸桿菌兩個階段進行。（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（1）計算（2）稱量（3）溶化（4）滅菌（5）倒平板1培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。4在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。（二）純化大腸桿菌微生物接種的方法中，最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。平板劃線法通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這樣的細菌群體叫菌落。1為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。2在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。三、結果分析與評價1、未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？未接種的培養(yǎng)基上是不會有菌落生長的。如果有，則證明培養(yǎng)基滅菌不徹底，或培養(yǎng)基被污染。這樣的培養(yǎng)基要重新滅菌。2、在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，你是否觀察到了獨立的菌落？這些菌落的顏色、形狀和大小相似嗎？如果在接種大腸桿菌的過程中接種操作是符合要求的，則在培養(yǎng)基上會出現(xiàn)獨立的菌落，生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點。如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。3、培養(yǎng)12小時和24小時后，觀察到的實驗結果相同嗎？如果不同，請分析產生差異的原因？培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。4、如果你在培養(yǎng)基上觀察到了不同形態(tài)的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎？感染雜菌發(fā)生變異四、練習1提示