青霉素生產(chǎn)工藝

青霉素生產(chǎn)工藝摘要：青霉素是人類最早發(fā)現(xiàn)的抗生素，其殺傷革蘭氏陽性細菌的神奇功效幾乎人人都曾領(lǐng)教過。它的發(fā)現(xiàn)對藥物學(xué)乃至整個人類發(fā)展的重要意義可以說是有口皆碑，以致于人們把青霉素的發(fā)現(xiàn)使用列入二十一世紀給人類生活帶來巨大變化的科技貢獻。本文將對青霉素的生產(chǎn)工藝及其提取進行深入的講解。關(guān)鍵詞：青霉素生產(chǎn)工藝發(fā)酵提取一、 前言青霉素又被稱為青霉素G、盤尼西林、配尼西林、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀。青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細菌的細胞壁并在細菌細胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素類抗生素是P-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱。1929年英國學(xué)者弗萊明首先在抗生素中發(fā)現(xiàn)了青霉素，英國謝菲爾德大學(xué)病理學(xué)家弗洛里實現(xiàn)對青霉素的分離與純化，并發(fā)現(xiàn)其對傳染病的療效，與英國生物化學(xué)家錢恩共獲1945年諾貝爾獎。青霉素分為天然的和半合成的，天然的青霉素是通過菌種發(fā)酵得到的。本文在簡述青霉素作用的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵法生產(chǎn)青霉素的工藝流程和精制提取青霉素進行詳細的講解。二、 青霉素的生物學(xué)特性青霉素類抗生素是P-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱，由于P-內(nèi)酰胺類作用于細菌的細胞壁，而人類只有細胞膜無細胞壁，故對人類的毒性較小，除能引起嚴重的過敏反應(yīng)外，在一般用量下，其毒性不甚明顯，但它不能耐受耐藥菌株（如耐藥金葡）所產(chǎn)生的酶，易被其破壞，且其抗菌譜較窄，主要對革蘭氏陽性菌有效。青霉素G有鉀鹽、鈉鹽之分，鉀鹽不僅不能直接靜注，靜脈滴注時，也要仔細計算鉀離子量，以免注入人體形成高血鉀而抑制心臟功能，造成死亡。三、 青霉素生長菌青霉素最初是從點青霉素產(chǎn)生，生產(chǎn)能力很低，后來找到適于深層培養(yǎng)的產(chǎn)黃青霉菌，經(jīng)一系列的誘變、雜交、育種，才得到高產(chǎn)的菌種。目前國內(nèi)青霉素的生產(chǎn)菌種按菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種。絲狀菌和球狀菌對原材料和培養(yǎng)條件的要求有一定的差別，產(chǎn)生青霉素的能力也有差異。球狀菌的發(fā)酵單位雖高，但對原材料和設(shè)備要求較高，且提煉收率也低于絲狀菌，因此國內(nèi)青霉菌生產(chǎn)廠大都采用綠色絲狀菌。

四、青霉素的發(fā)酵青霉素的發(fā)酵屬于次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵，發(fā)酵過程一般分為菌體生長、產(chǎn)物合成和菌體自溶三個階段。在菌體生長階段，碳源和氮源等被分解代謝，濃度明顯下降，菌體進行合成代謝。隨著菌體濃度的不斷增加，攝氧率也不斷增大，溶氧濃度不斷下降。當(dāng)菌體生長進入穩(wěn)定期時，菌體濃度降至最小。當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)降到一定水平時，其中某一參數(shù)可能成為菌體生長的限制性因數(shù)，使菌體生長速率減慢。同時，在大量合成菌體期間，積累了相當(dāng)量的某些代謝中間體，原有酶的活力下降，出現(xiàn)了與次級代謝有關(guān)的酶或其酶被解除了控制，導(dǎo)致菌體的生理狀況發(fā)生改變，發(fā)酵就從菌體生長階段轉(zhuǎn)入產(chǎn)物合成階段。這個階段一般稱為菌體生長期或發(fā)酵前期。在產(chǎn)物合成階段，產(chǎn)物的生成量逐漸增多，直至達到高峰，生產(chǎn)速率也達到最大，直至產(chǎn)物合成能力減退。在這個階段，菌體的呼吸強度一般無顯著變化，菌體物質(zhì)的合成仍未停止，菌體的質(zhì)量有所增加，但此時菌體細胞基本不繁殖。這個階段的代謝變化是以碳源和氮源的分解代謝和產(chǎn)物的合成代謝為主，碳、氫等營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，產(chǎn)物不斷被合成。外界的環(huán)境變化很容易影響這個階段的代謝。碳源、氮源和磷酸鹽等的濃度必須控制在一定的范圍內(nèi)，發(fā)酵條件也要嚴格控制，才能促使產(chǎn)物不斷被合成。在菌體自溶階段，菌體開始衰老，細胞開始自溶，培養(yǎng)基中碳、氮含量增加，PH上升，產(chǎn)物合成能力衰退，生產(chǎn)速率下降。發(fā)酵到此必須結(jié)束，否則產(chǎn)物不僅受到破壞，還會因菌體自溶而給發(fā)酵液的過濾和提取帶來困難。青霉素生產(chǎn)菌不同，發(fā)酵工業(yè)也有區(qū)別。25C，6?7d)25C，40?45h)6?7d)f放罐25C，6?25C，6?7d)25C，40?45h)6?7d)f放罐25C，6?8d)28C，50?球狀菌的青霉素發(fā)酵工藝流程：冷凍管f斜面母瓶（孢子培養(yǎng)，f大米孢子斜面（孢子培養(yǎng)，25C，8?10d）f種子罐（種子培養(yǎng)，60h）f發(fā)酵罐（發(fā)酵，26C，6?7d）f放罐青霉素的分批發(fā)酵分為菌絲生長和產(chǎn)物合成兩個階段，進入合成階段的必要條件是降低菌絲的生長速率。影響青霉素發(fā)酵產(chǎn)率的因素有環(huán)境和生理因素兩個方面，前者包括溫度、PH、培養(yǎng)基種類及濃度、溶解氧飽和度等；后者包括菌體濃度、菌體生長速率、菌絲形態(tài)等。菌體生長和青霉素合成最適溫度并不相同，一般前階段略高于后階段。因此，在菌體生長階段可以采取較高溫度，以縮短生長時間，而到達產(chǎn)物合成階段，應(yīng)適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素的合成。青霉素發(fā)酵的最適PH一般在6.5左右，由于青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，容易發(fā)生水解，因此應(yīng)盡量避免 PH超過7.0。五、青霉素的提取1、 發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵液預(yù)處理是抗生素分離純化的第一道工序。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中抗生素的濃度通常很低，而雜質(zhì)的含量通常很高，包括有大量的菌體細胞、未用完的培養(yǎng)基、各種蛋白質(zhì)膠狀物以及其他代謝產(chǎn)物等。發(fā)酵液預(yù)處理主要去除兩大類物質(zhì)：一類是可溶性物質(zhì)，包括核酸、雜蛋白質(zhì)、不溶性多糖等，這些雜質(zhì)不僅使發(fā)酵液粘度提高，影響液固分離速率，而且還會影響提取操作；另一類是某些無機鹽，它們不僅影響成品質(zhì)量，而且在采用離子交換法提取時，由于樹脂大量吸附無機離子而減少對抗生素的交換，因此，應(yīng)將這些無機離子，特別是高價金屬離子除去。發(fā)酵液放罐后，首先要冷卻，因為青霉素在低溫時比較穩(wěn)定，細菌繁殖也比較慢，可避免青霉素迅速被破壞。青霉素菌絲教粗，一般過濾較容易，通常采用鼓式過濾及板框過濾；蛋白質(zhì)的處理方法包括等電點沉淀、變性沉淀、沉淀劑沉淀、凝聚劑沉淀、絮凝劑沉淀；吸附、酶解法去除不溶性多糖等；高價金屬離子的去除方法有離子交換法和沉淀法等。2、 青霉素的提取青霉素的提取方法包括離子交換法、吸附法、沉淀法和溶劑萃取法等。離子交換法利用離子交換樹脂作為吸附劑，將青霉素從發(fā)酵液中吸著在樹脂上，然后在適宜的條件下洗脫下來，達到分離、濃縮、提純的目的。由于離子交換法具有成本低、設(shè)備簡單、不用或少用有機溶劑等優(yōu)點，已成為提取抗生素的重要方法之一。隨著大網(wǎng)格聚合物吸附劑的合成和發(fā)展，吸附法重新為抗生素工業(yè)所重視而獲得應(yīng)用。吸附法具有操作簡便、安全、設(shè)備簡單、不用或少用有機溶劑、生產(chǎn)過程中PH變化小等優(yōu)點。但吸附法選擇性差，收率不高。常規(guī)吸附劑按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為兩大類；一類是有機吸附劑，如活性炭、纖維素、大孔樹脂等；另一類是無機吸劑，如氧化鋁、硅膠、硅藻土、碳酸鈣等。沉淀法是利用抗生素在一定的PH條件下，與某些金屬離子或其他化合物的整個分子結(jié)合成難易溶解的鹽或復(fù)鹽沉淀出來，以達到濃縮和提純的目的。利用某些抗生素具有兩極化合物的性質(zhì)，使其在等電點時從水溶液中游離而沉淀出來，直接得到成品。根據(jù)抗生素的理化性質(zhì)、提取工藝條件和所得沉淀物的情況，沉淀法一般可分為間接沉淀法和直接沉淀法兩種類型。溶劑萃取法按操作方式可以分為單級萃取和多級萃取，后者又可以分為錯流萃取和逆流萃取。單級萃取只包括一個混合器和一個分離器。料液經(jīng)萃取后的萃取液再用新鮮萃取劑進行萃取稱為多級錯流萃取。溶劑萃取法提取青霉素的效果除了已選定已選定適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑、破乳化劑和離心分離設(shè)備外，還與 PH、溫度和萃取方式及濃縮比等因素有關(guān)。青霉素在酸性條件下極易被水解破壞，生成青霉素酸，但根據(jù)PK值的要求，又一定要在酸性時才能將青霉素轉(zhuǎn)移到有機溶劑中，因此合適的PH很重要。在中性PH下青霉素以成鹽的形式溶于水中，轉(zhuǎn)移也較完全。如果堿性過強，則已發(fā)生堿性水解，而且雜質(zhì)也易轉(zhuǎn)到水相中，質(zhì)量也較差。在低溫條件下提取青霉素較為有利，并且提取過程中停留的時間越短越好。青霉素在丁酯中于0?15°C放置24h不致?lián)p失效價，但在溫室下效價損失可達5.32%。萃取方式和濃縮比也有很大影響，根據(jù)萃取方式和理論收得率的計算得知，多級逆流萃取較理想，目前生產(chǎn)上采用二級逆流萃取方式。濃縮比的選擇也很重要，因為丁酯的用量與收率和質(zhì)量都有關(guān)系。若丁酯用量太多，雖然萃取較完全、收率高，但達不到結(jié)品濃度要求，反而增加溶劑的耗用量；若丁酯用量太少，則萃取不完全，影響收率。六、抗生素的精制1、 濃縮在抗生素提取和精制的過程中，常需要通過蒸發(fā)將發(fā)酵濾液或提取液進一步濃縮，以利于后序操作?？股厣a(chǎn)中有真空濃縮和薄膜蒸發(fā)濃縮。2、 干燥干燥的目的是除去抗生素中所含的水分，以提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品的加工、儲存和使用。常用的干燥方法有減壓干燥、噴霧干燥、氣流干燥、冷凍十燥等。此外也有使用常壓干燥、固定床干燥及紅外線干燥等。3、 脫色和去熱原提煉往往是注射用抗生素提取中不可缺少的一個單元操作。這一步操作的好壞，不僅影響下一道工序，更重要的是關(guān)系到成品的色極及熱原試驗等質(zhì)量指標。用活性碳可除去各種色素，同時也能出去熱原。4、 結(jié)晶抗生素的精制過程中常常通過結(jié)品的方法來制得較高純度的成品。抗生素的精制方法很多，生產(chǎn)中常用的結(jié)品方法有以下幾種：改變溫度結(jié)品、利用等電點結(jié)品、加成鹽劑結(jié)品、加入不同溶劑結(jié)品、共沸結(jié)品。另外還有鹽析法、中間鹽轉(zhuǎn)移法、品體洗滌法等幾種精制方法。重結(jié)品是進一步提純精制抗生素的有效方法，通過重結(jié)品方法可獲得高純度抗生素產(chǎn)品。七、結(jié)論發(fā)酵罐是現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)的象征，它是微生物在發(fā)酵過程中生長、繁殖和形成產(chǎn)品的外部環(huán)境裝置，它取代了傳統(tǒng)的發(fā)酵容器：培養(yǎng)瓶、醬缸和酒窖，它能實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)，最大限度地利用原料和設(shè)備，獲得高產(chǎn)量和高效率。對青霉素生產(chǎn)的改進得益于來自于生物化學(xué)、遺傳學(xué)、微生物生理學(xué)以及生化工程等方面科技人員的共同努力。迄今為止，人們對青霉素生物合成的了解還十分膚淺，大部分機理仍還無法闡述清楚，然而可以預(yù)計，隨著對青霉素發(fā)酵過程和代謝途徑認識的不斷深入，人們一定能夠找到某種適當(dāng)?shù)霓k法來解決青霉素合成中的阻遏因素，從而大幅度提高青霉素的效價和產(chǎn)量。參考文獻1、 宇龍江.發(fā)酵工程原理與技術(shù)應(yīng)用.2006年9月第一版.2、 程殿林.微生物技術(shù)工程技術(shù)原理.2007年5月第一版.3、 黃儒強，李玲.生物發(fā)酵技術(shù)與設(shè)備操作.2006年9月第一版.4、 童海寶.生物化工.2001年一月第一版.5、 華北制藥廠技術(shù)情報組.六十年代以來國外青霉素發(fā)酵工藝研究.中國抗生素雜志，1997，(03).6、 王耀偉.青霉