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文檔簡介
湖南中醫(yī)藥大學
生物技術論文學生姓名: 劉婷學號:200904090135學院: 藥學院專業(yè)年級: 09食品科學與工程 題目:飛躍中的基因技術乳酸發(fā)酵評閱教師:曾老師2011年5月飛躍中的基因技術一乳酸發(fā)酵
摘要:乳酸菌是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌。乳酸菌能夠將碳水化合物發(fā)酵成乳酸,因而得名。常添加在酸奶之內(nèi)。采用了基因工程研究方法,建立乳酸菌基因表達系統(tǒng),從基因水平改進產(chǎn)品質地,對天然的乳酸菌進行改良,將對人類健康密切相關的基因(如轉鐵蛋白,乳鐵蛋白,GST等基因)在乳酸菌中分泌表達,制備對人類健康具有明確醫(yī)療保健作用的乳酸菌飲料。關鍵詞:基因技術發(fā)酵劑食品級酶異源蛋白質基因突變關鍵步驟1緒論1.1發(fā)展歷史20世紀80年代以來基因工程技術已經(jīng)開始在乳酸發(fā)酵劑領域進行研究了,利用基因工程技術改造傳統(tǒng)的發(fā)酵食品用微生物是當前食品生物技術領域的一個新的研究熱點。近10年來,基因工程技術主要應用于乳酸發(fā)酵工業(yè)以下幾個方面:噬菌體抗性菌株的分子育種;質粒相關的穩(wěn)定作用;增強干酪的風味和質構,加速干酪的成熟;細菌素和其它天然抗生素的產(chǎn)生;生物膠的產(chǎn)生;風味缺陷的控制;益生素的產(chǎn)生;食品級酶和異源蛋白質的產(chǎn)生;降低莫茲瑞拉干酪的棕色化;發(fā)展適用于低脂防乳制品的發(fā)酵劑;發(fā)展冷敏感型發(fā)酵劑。大多數(shù)發(fā)酵食品中含有未滅活的發(fā)酵微生物,并隨食品進入人體,因此利用基因重組技術改造食品用微生物時,首先應保證具有足
夠的安全性。有了食品級基因修飾菌的明確定義,美國、荷蘭、丹麥等國的研究人員作了大量有關用基因工程技術改良乳制品發(fā)酵劑的研究,而這個領域的研究在國內(nèi)仍屬于空白。本文的目的就在于將當前國際上利用基因工程修飾、改變傳統(tǒng)乳制品發(fā)酵劑的研究現(xiàn)狀進行總結,以促進國內(nèi)食品生物技術的發(fā)展。1.2現(xiàn)狀生物技術應用于食品有著悠久的歷史,隨著生物技術的蓬勃發(fā)展,對于促進食品的發(fā)展有著巨大的貢獻。近年來基因工程技術的發(fā)展為食品提供了新的發(fā)展契機。為世界所面臨的糧食短缺以及品質要求找到了新的解決途徑。也為食品工業(yè)提供營養(yǎng)豐富的動植物原材料、性能優(yōu)良的微生物菌種以及高活而價格適宜的酶制劑,而且還可以賦予食品多種功能、優(yōu)化生產(chǎn)工藝和開發(fā)新型功能性食品。所以,基因工程正在使食品業(yè)發(fā)生著深刻的變革。而基因工程技術改造傳統(tǒng)的發(fā)酵食品用微生物是當前食品生物技術領域的一個新的研究熱點,倍受大家的關注。2基因技術在乳酸菌中的應用原理。2.1乳酸菌的基因工程育種。我們大家都知道:乳酸菌是一類能代謝產(chǎn)生乳酸,降低發(fā)酵產(chǎn)品pH值的一類微生物。乳酸菌基因表達系統(tǒng)分為組成型表達和受控表達2種類型,其中受控表達系統(tǒng)包括糖誘導系統(tǒng)到安全、豐富、營養(yǎng)的食品到安全、豐富、營養(yǎng)的食品誘導系統(tǒng)、pH誘導系統(tǒng)和噬菌體衍生系統(tǒng)。相對于乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌而言,德氏乳桿菌的基因研究比較缺乏,但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)質粒pN42和PJBL2用于構建德氏乳桿菌的克隆載體。乳酸菌基因突變有2種方法:第一種方法涉及(同源或異源的)可獨立復制的轉座子,第二種方法是依賴于克隆的基因組DNA片斷和染色體上的同源部位的重組整合而獲得的。完整的基因組序列的破譯并沒有改變這些基本方法,然而這已經(jīng)極大地提高了選擇用于研究基因位點的速度,而且現(xiàn)有的基因組序列大大提高了隨機整合體的定位能力和預測遺傳前景的能力。食品級基因修飾菌是指被導入源于同種或公認的安全的食品級微生物的基因,并因此而具有某種優(yōu)良性狀的用于發(fā)酵食品生產(chǎn)的微生物。其基因修飾過程應滿足下列要求:1、功能性基因必須源于同種菌或公認的安全的食品級微生物;2、載體必須是食品級的,不得含有非食品級的功能性DNA片段;3、選擇性標記不得選用各種抗生素抗性標記,防止抗生素抗性基因隨菌體進入人體。應選用食品級的標記基因,如糖類利用標記、營養(yǎng)缺陷型標記等;4、宿主菌的遺傳特性清楚且穩(wěn)定,具有足夠的安全性,應選用適當?shù)姆肿由飳W方法如DNA序列分析、雜交等確定宿主菌的遺傳組成。3影響乳酸菌發(fā)酵劑性能的因素乳制品發(fā)酵劑依產(chǎn)品主要可分為奶酪發(fā)酵劑、酸奶發(fā)酵劑、奶油發(fā)酵劑三大類。無論是哪種發(fā)酵劑,人們最關注的性能有以下幾個方面:產(chǎn)生雙乙酰的能力;蛋白水解能力;產(chǎn)生胞外多糖的能力;抗病原菌、雜菌污染能力;抗噬菌體侵染能力。下文將從這幾個方面闡述用基因技術改良乳制品發(fā)酵劑的思路及研究成果。3.1產(chǎn)雙乙酰能力乳制品發(fā)酵風味(如黃油,酸奶等)的核心成分是雙乙酰。對大多數(shù)乳酸菌而言,乳糖分解成為葡萄糖和半乳糖,其經(jīng)過糖酵解途徑轉化成丙酮酸,再在乳酸脫氫酶的催化作用下還原,轉變?yōu)槿樗帷I倭康谋嵩赼-乙酰乳酸合成酶的作用下形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物a-乙酰乳酸,極易受a-乙酰乳酸脫羧酶作用形成3-羥基-2-丁酮,并最終被緩慢氧化成2,3-丁二醇。一些乳酸菌突變菌株具有很強的雙乙酰產(chǎn)生能力,研究證實這些菌株體內(nèi)沒有a-乙酰乳酸脫羧酶。據(jù)此可以認為,在沒有a-乙酰乳酸脫羧酶存在時,a-乙酰乳酸會積累,在有氧氣存在時經(jīng)化學氧化過程轉變成為雙乙酰。這也是雙乙酰產(chǎn)生的機理。根據(jù)此原理,假若使菌株喪失合成a-乙酰乳酸脫羧酶的能力,a-乙酰乳酸會積累,菌株產(chǎn)生雙乙酰的能力就會提高。目前工業(yè)上廣泛應用的產(chǎn)雙乙酰能力強的菌株就是a-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型菌株,但是它對噬菌體較敏感,一旦噬菌體浸染發(fā)生,沒有菌株可以替換它。這才促使人們利用基因工程技術去獲得ALD缺陷型菌株。1996年Coupil報道了用基因工程技術篩選ALD缺陷型菌株的方法[7]。該方法的理論基礎是a-乙酰乳酸是3-羥基-2-丁酮的前體,也是亮氨酸纈氨酸合成的前體物質;當培養(yǎng)基中存在亮氨酸時,會產(chǎn)生抑制效應,即ALD被激活使a-乙酰乳酸發(fā)生脫羧反應,生成3-羥基-2-丁酮;反之,不存在亮氨酸時,ALD沒有活性,a-乙酰乳酸不能發(fā)生脫羧反應而轉向亮氨酸纈氨酸的生物合成。因此當培養(yǎng)基中有亮氨酸而無纈氨酸時,菌體細胞會因纈氨酸缺乏而無法生長。但是ALD缺陷型菌株在有亮氨酸而無纈氨酸基質中培養(yǎng)時,a-乙酰乳酸不會轉變成3-羥基-2-丁酮,菌體將正常進行亮氨酸纈氨酸的生物合成,進行各種生命活動。應用此原理篩選ALD缺陷型菌株需有一前提,即菌株要有合成纈氨酸的能力。但是,自然存在的乳酸菌菌株絕大多數(shù)已經(jīng)喪失了這種能力。為此,Curic將攜帶有纈氨酸合成酶基因的質粒載體PMC004電穿孔法轉化到宿主雙乙酰乳酸乳球菌中,使其獲得合成纈氨酸的能力。Curic的篩選過程為:出發(fā)菌株DB0410+質粒PMC004-轉化一含亮氨酸的化學合成培養(yǎng)基篩選一能夠合成纈氨酸的陽性轉化子(DB0410/PMC004,Val+)一ALD缺陷型篩選一DB0410/PMC004,ValALD-一去除質粒PMC004-MC010。最后獲得的菌株MC010不含有任何外源DNA,Southern雜交和DNA印記反應證明其基因圖譜同野生的L.lactisdiacetylactisDB0410是一樣的,因此具有足夠的安全性,是一食品級基因修飾菌。用該菌進行強化檸檬酸的M17培養(yǎng)基發(fā)酵實驗,產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸總量和對照組沒有明顯差異,而a-乙酰乳酸的產(chǎn)量MC010試制發(fā)酵奶油,產(chǎn)品在儲藏1d后,雙乙酰的濃度高達0.22mol/L,而對照組僅為0.01mol/L,儲藏1周后,雙乙酰的濃度降為0.04mol/L,對照組仍為0.01mol/L。3.2蛋白水解能力蛋白水解能力是衡量干酪發(fā)酵劑的重要指標。發(fā)酵劑在干酪的成熟過程中,水解乳蛋白,產(chǎn)生小分子肽和氨基酸,是成熟干酪的重要風味成分。乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)包括結合在細胞壁上的蛋白酶PrtP,其功能是將細胞外的蛋白質水解成寡聚多肽;細胞膜上的寡聚肽轉運子OPP,其功能是將寡聚多肽由細胞外轉運到細胞內(nèi),該步驟是乳酸乳球菌在牛乳中生長的關鍵步驟,OPP缺陷型的突變株不能在以酪蛋白為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長。細胞內(nèi)蛋白酶,如氨基肽酶pepN,二肽酶pepV,內(nèi)肽酶pepO,胱氨酸肽酶pepC等,將寡聚多肽最終水解為氨基酸。依據(jù)上述理論,國外科學工作者作了一些改良發(fā)酵劑蛋白水解能力的嘗試。HENRIKSEN等人將pepN,pepV,pepC,pepO蛋白酶基因分別克隆到pFG1質粒中,并分別在L.LactisMG1363中表達,制作成單一菌株的發(fā)酵劑,進行50g奶酪的生產(chǎn)實驗。結果表明,經(jīng)4?6個月的成熟期后,轉pepN和pepC基因的發(fā)酵劑作成的奶酪;同對照組相比,苦味明顯降低,嗜好性味增加;而轉pepO和pepV基因的發(fā)酵劑同對照組沒有明顯差異。由于乳酸菌的多數(shù)蛋白酶屬于胞內(nèi)酶,因而有人認為在奶酪發(fā)酵成熟的過程中,菌體可能會發(fā)生裂解,釋放胞內(nèi)酶,進而水解介質中的蛋白質。將噬菌體溶菌酶基因①VML3克隆到PFG1質粒中,并在MG1363中表達,制作成相應的發(fā)酵劑和奶酪,結果乳酸菌在奶酪成熟后期的自溶能力顯著增強,苦味顯著降低,嗜好性味顯著增強。3.3胞外多糖的形成在酸奶及其他一些發(fā)酵乳制品發(fā)酵過程中,乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖可使產(chǎn)品增稠、穩(wěn)定,質地細膩均勻,口感潤滑。乳酸菌分泌胞外多糖的能力很不穩(wěn)定,即便是在最佳的培養(yǎng)條件下,多次的移接操作或培養(yǎng)時間延長都可能造成菌株分泌胞外多糖能力的喪失。乳酸菌遺傳學表明,乳脂乳球菌和乳酸乳球菌合成胞外多糖的關鍵基因在質粒上,乳酸菌容易喪失分泌胞外多糖的能力是由于質粒的不穩(wěn)定性造成的。目前遺傳特性研究的最為清楚的是源于L.LactisN120b40的質粒pNZ4000,它是一含有多個功能性基因的復合質粒(40kb),其中與胞外多糖合成有關的14個基因構成一個12kb的操縱子。由于胞外多糖對產(chǎn)品黏度與質地的影響是與其分子大小密切相關的,因此從基因水平改進產(chǎn)品質地的另一個思路是提高胞外多糖的分子量。通過控制胞外多糖分子延長基因的表達水平可以實現(xiàn)控制胞外多糖分子大小的目的。研究表明,在胞外多糖的絕對產(chǎn)量不增加的情況下,僅將胞外多糖的分子量提高一倍,就可以使產(chǎn)品的黏度與質地發(fā)生顯著變化。3.4抗雜菌、病原菌污染特性許多乳酸菌在發(fā)酵過程中除產(chǎn)生乳酸、乙酸和雙乙酰外,還可產(chǎn)生一些具有抑菌和殺菌作用的細菌素,在食品的防腐保鮮中起重要作用。如目前研究得最徹底、應用最廣的有乳酸乳球菌產(chǎn)生的乳鏈球菌素(Nisin)、乳酸片球菌產(chǎn)生pediocinPA-1、乳酸乳桿菌產(chǎn)生的lactacinF。這些細菌素都是經(jīng)核糖體合成機制產(chǎn)生的多肽類物質(在這一點上同普通抗生素有本質的區(qū)別),產(chǎn)生菌對其細菌素有自身免疫性。分子遺傳學研究表明,乳酸乳球菌的Nisin結構基因位于染色體的可結合轉座子(70kb)上,其中在10kb的片段上分布著NisA.B.T.Z.P.K基因,構成一個8.5kb的多順反操縱子,5'端有一核糖體結合位點,3'端有一個終止密碼子和依賴P因子的轉錄終止子。Nisin的前體肽有57個氨基酸組成,其中N端23個殘基為信號肽,它在細胞表面會被信號肽酶水解去除,最終釋放出成熟的有活性的Nisin?;谏鲜龅难芯砍晒?,國外研究者嘗試用基因工程技術增強奶酪發(fā)酵劑產(chǎn)生Nisin的能力,但結果卻不盡人意。產(chǎn)生Nisin的能力提高的同時,乳糖代謝的速度下降,發(fā)酵劑的蛋白質水解能力及耐熱性也都下降。分析原因,認為奶酪的發(fā)酵劑是混合型的,含有多種乳酸菌,產(chǎn)Nisin的菌株對不產(chǎn)Nisin的菌株的生命活動有拮抗作用。Nisin嘗試將片球菌素pdiococin基因克隆并在乳酸球菌中表達的試驗。Pdiococin-PA-1由乳酸片球菌Pediococcusacidlactici產(chǎn)生,該菌乳糖發(fā)酵能力弱,它主要是作為生物防腐劑控制食品中的雜菌和病源菌。Pdiococin-PA-1的相關基因在質粒上,是一個含4個基因的操縱子。將該操縱子克隆并構建成食品級表達載體pMC117質粒,轉化到乳酸乳球菌MM214中,得工程菌MM217。以此菌制作成發(fā)酵劑,并進行奶酪得生產(chǎn)試驗。結果表明,試驗組奶酪在發(fā)酵1d時含64000Pediocin,6個月后降到2000,而對照組沒有檢測到Pediocin活性。試驗組奶酪的Lister菌數(shù)比對照組低1000倍以上。說明該菌產(chǎn)Pediocin能力高,且能有效殺死、抑制Lister菌。同時該發(fā)酵劑的糖代謝速度、產(chǎn)酸速度、產(chǎn)品的PH值、水分含量等發(fā)酵指標和產(chǎn)品指標同對照組相比都沒有明顯差異。提高發(fā)酵劑抗雜菌污染能力的另一個思路就是將噬菌體編碼的細菌細胞壁裂解酶基因導入發(fā)酵劑乳酸菌,提高其抗菌能力。將Listeria菌的噬菌體胞壁裂解酶(可專一性水解Lister菌細胞壁肽聚糖的肽鍵)的操縱子克隆到PTRKH2質粒上,構建成表達載體,導入乳酸乳球菌可實現(xiàn)胞壁裂解酶的成功分泌,使培養(yǎng)基中的Lister菌迅速裂解。4實際應用其中,復旦大學采用了基因工程研究方法,建立乳酸菌基因表達系統(tǒng),對天然的乳酸菌進行改良,將對人類健康密切相關的基因(如轉鐵蛋白,乳鐵蛋白,GST等基因)在乳酸菌中分泌表達,制備對人類健康具有明確醫(yī)療保健作用的乳酸菌飲料。[預期成果和市場前景分析]:建立乳酸菌基因轉移表達系統(tǒng);制備具有特定明確醫(yī)療和保健功能的基因工程乳酸菌。被譽為第三代乳酸菌的基因工程乳酸菌具有特定的明確的醫(yī)療保健功能,市場前景廣闊。例如轉鐵蛋白和乳鐵蛋白則能夠明確促進食物中鐵的
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