谷氨酸搖瓶發(fā)酵

谷氨酸搖瓶補料發(fā)酵班級：生物工程091班姓名：XXX學(xué)號：XXXXXXXXXXXXX指導(dǎo)老師：XX谷氨酸搖瓶補料發(fā)酵摘要：本實驗以天津短桿菌為菌種，在不同培養(yǎng)基條件下研究搖瓶補料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸。試驗中以0D值檢測天津短桿菌的生長狀況，以殘?zhí)橇亢凸劝彼嵘闪靠刂蒲a料情況。實驗結(jié)果表明：在相同培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度32°C，培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速240rpm）下，蛋白胨培養(yǎng)基最高產(chǎn)酸為19g/L，玉米漿70%梯度培養(yǎng)基的最高產(chǎn)酸量為12g/L,根據(jù)以上結(jié)果可以看出，蛋白胨培養(yǎng)基的產(chǎn)酸量高于梯度培養(yǎng)基。關(guān)鍵詞：谷氨酸補料發(fā)酵OD值殘?zhí)橇可锼厍把裕?866年德國H.ittthausen用硫酸水解小麥面粉，分離到一種酸性氨基酸，依據(jù)原料的取材將它命名為谷氨酸。1872年Hasiwitz和Habermaan用酪蛋白水解也制得谷氨酸。1908年日本池田菊苗在探討海帶汁鮮味時，提取了谷氨酸，開始制造“味之素”1901年日本味之素公司用水解面筋法生產(chǎn)谷氨酸。1936年美國從甜菜廢液（斯蒂芬廢液）中提取谷氨酸。1954年多田、中山兩人報告了采用微生物直接發(fā)酵谷氨酸的研究。直到1956年日本協(xié)和發(fā)酵公司的木下祝郎分離選育出一種新的細菌——谷氨酸棒狀桿菌，能同化利用100g葡萄糖，可直接發(fā)酵并積累40g以上的谷氨酸。隨后進行了工業(yè)化研究，自1957年起發(fā)酵法制取味精，正式商業(yè)化生產(chǎn)。20世紀60年代后，世界各國也興起發(fā)酵法生產(chǎn)味精，以甘蔗或甜菜、糖蜜、淀粉、醋酸、乙醇為原料，由于石油價格上漲和石油制品的安全性，相繼改用糖蜜、淀粉原料為

主的發(fā)酵法生產(chǎn)味精。谷氨酸發(fā)酵機制：谷氨酸的生物合成途徑主要包括：EMP途徑、HMP途徑、TCA循環(huán)、乙醛酸循環(huán)、C02固定反應(yīng)?？偡磻?yīng)途徑為：糖經(jīng)過EMP途徑和HMP生成丙酮酸。一方面丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-CoA；另一方面，經(jīng)CO2固定作用生成草酰乙酸；兩者合成檸檬酸進入TCA循環(huán)，由三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物a-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶的催化下，還原氨基化合成谷氨酸。船萄幣f-磷酸 —磷酸酸*■乙朋匚航戊C￡巨亠)丙陽酸臣酰乙酸李果酸(VUH)船萄幣f-磷酸 —磷酸酸*■乙朋匚航戊C￡巨亠)丙陽酸臣酰乙酸李果酸(VUH)延胡索酸乙醜G.A檸掾酸（乙能酸循壞）\乙醯酸順烏尹酸谷氨酸發(fā)酵注意事項：在發(fā)酵過程中，氧、溫度、pH和磷酸鹽等的+ 透過細胞膜（ 調(diào)節(jié)和控制如下：①氧，谷氨酸產(chǎn)生菌是好氧菌，通風(fēng)和攪拌不僅會影響菌種對氮源和碳源的利用率，而且會影響發(fā)酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在發(fā)酵后期，加大通氣量有利于谷氨酸的合成。其中谷氨酸棒狀桿菌在溶氧不足時產(chǎn)生的是乳酸或琥珀酸。②溫度。菌種生長的最適溫度為30~32°C。當菌體生長到穩(wěn)定期，適當提高溫度有利于產(chǎn)酸，因此，在發(fā)酵后期，可將溫度提高到34?37C。③pH。谷氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵的最適pH在7.0?8.0。但在發(fā)酵過程中，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的利用，代謝產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)液的pH會不斷變化。如隨著氮源的利用，放出氨，pH會上升；當糖被利用生成有機酸時，pH會下降。其中谷氨酸棒狀桿菌在pH呈酸性時生成乙酰谷胺酰胺。④磷酸鹽。它是谷氨酸發(fā)酵過程中必需的，但濃度不能過高，否則會轉(zhuǎn)向纈氨酸發(fā)酵。材料和方法1.1材料和儀器菌種谷氨酸短桿菌TG866,廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院微生物實驗室提供1.1.2材料葡萄糖、玉米漿、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、尿素、aCl、KHPO、2 4MgSO、KHPO、HCl、NaOH4 2 41.1.3培養(yǎng)基活化斜面培養(yǎng)基(5支)葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，NaCl2.5g/L，瓊脂15~20g/L，PH7.0~7.2，共配50mL，分裝10mL/支；滅菌：115C，25min。擺斜面。（2）種子培養(yǎng)基兼發(fā)酵培養(yǎng)基（2瓶）葡萄糖100g/L，蛋白胨3g/L,MgSO0.8g/L,KHP03.5g/L,4 2 4KHPOlg/L,20%尿素1.2mL/瓶（接種前在無菌室加入），共配60mL,2 4分裝30mL/500mL三角瓶，滅菌：115°C,25min。在無菌室加入1.2mL尿素后，調(diào)節(jié)7.2~7.5。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（2瓶）葡萄糖70g/L，玉米漿3g/L,MgSO0.8g/L,KHPO3.5g/L,4 2 4KHPOlg/L,20%尿素1.2mL/瓶（接種前在無菌室加入），共配60mL,2 4分裝30mL/500mL三角瓶，滅菌：115C,25min。在無菌室加入1.2mL尿素后，調(diào)節(jié)7.2~7.5。所有培養(yǎng)基均調(diào)PH7.0~7.2,在115C高溫下滅菌15分鐘1.1.4相關(guān)試劑0.9%生理鹽水：稱取0.9gNaCl溶解于蒸餾水并定容至100ml。50%葡萄糖：稱取40葡萄糖溶解于蒸餾水并定容至80ml，用于補料。20%尿素：稱取22g尿素溶于蒸餾水并定溶至100ml,過濾除菌。3mol/LHCL:取12mol/L濃HCL令HCL：H2O為1:3（體積比）配制100ml。加ol/LNaOH:稱取8gNaOH固體溶解于蒸餾水并定容至100ml。1.1.5實驗儀器與設(shè)備超凈臺，生物傳感分析儀，搖床，722光柵分光光度計，移液槍，滅菌鍋，光波爐3.2 試驗方法1.2.1活化菌種轉(zhuǎn)接活化斜面，將天津短桿菌轉(zhuǎn)接到活化斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)20h.1.2.2種子培養(yǎng)（1） 向已經(jīng)滅菌的種子培養(yǎng)基（蛋白胨3g/L）加入1.2mL尿素，用加ol/L的NaOH或加ol/L的HCL調(diào)至PH7.2，按1mL生理鹽水/I支大斜面的用量，將活化斜面的菌種洗下，混勻。按3%的接種量（ImL）接入種子培養(yǎng)基，9層紗布封口，240rpm,32C搖瓶培養(yǎng)7~8h使菌種長至對數(shù)生長中后期。這兩瓶種子培養(yǎng)基擴陪7~8h后直接用于搖瓶補料發(fā)酵30h。（2） 測定OD值：0h測定一次，7h測定一次，若OD值凈增0.5以上,即可用于接種發(fā)酵培養(yǎng)基。1.2.3搖瓶補料發(fā)酵（1） 向已經(jīng)滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖70g/L）加入1.2mL尿素，用加ol/L的NaOH或加ol/L的HCL調(diào)至PH7.2,將種子培養(yǎng)基按10%的接種量（3mL）將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻。9層紗布封口，240rpm,32C搖瓶培養(yǎng)約30h。（2） 測定OD值、OH、殘?zhí)橇考肮劝彼崃浚涸跓o菌臺取樣0.5mL至離心管中，殘夜測定PH,酌情加入尿素0.2~0.6mL補料，使PH維持在7.2~7.5，酌情加入50%葡萄糖補料，使殘?zhí)蔷S持在20~30g/L，測定OD值、OH、殘?zhí)橇考肮劝彼崃浚?h測定一次，大約每3h測定一次。1.2.4測定方法（1） 菌種生長情況吸取0.5mL發(fā)酵液于1.5mL離心管中，8000r/min離心3min。上清液用于測量殘?zhí)呛萌斯劝彼岙a(chǎn)量，沉淀稀釋100倍，用紫外可見分光光度計在620nm波長下測其OD值，菌種的OD值可以反應(yīng)菌體的濃度，通過菌體濃度可知菌體生長情況。（2） 殘?zhí)橇亢凸劝彼崃康臏y定上1中的上清液稀釋100倍，即用0.1mL稀釋到10mL比色管中定溶，搖勻，用生物傳感分析儀測定殘?zhí)呛凸劝彼崃?。?） PH的測定用PH6.4~8.0的pH精密試紙測定pH值。實驗結(jié)果和分析2.1實驗結(jié)果根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方不同，含有蛋白胨的培養(yǎng)基簡稱為蛋白胨1和蛋白胨2；不含蛋白胨，但含有玉米漿的培養(yǎng)基簡稱為梯度1和梯度2。實驗數(shù)據(jù)如下表:時間PH值殘?zhí)?(g/L)谷氨酸/(g/L)OD值補加尿素/mL補加葡萄糖/mL07.25110.610.204.575410.6810.4087.74750.77900117.7406.50.74700137.2377.50.8520.24245.477100.89800275.488100.89800表1蛋白胨1的發(fā)酵記錄時間PH值殘?zhí)?(g/L)谷氨酸/(g/L)OD值補加尿素/mL補加葡萄糖/mL07.2———004.5>85110368001184520.50000137.54230.55800245.43460.7760027<5.43670.82800表2梯度1的發(fā)酵記錄時間PH值殘?zhí)?(g/L)谷氨酸/(g/L)OD值補加尿素/mL補加葡萄糖/mL07.24830.5870.204.57.75060.6980085.44390.7111.5011834110.6980013831140.72705246.483180.79300275.894190.84400表3蛋白胨2的發(fā)酵記錄2724ooi―L005o54on4y20000V00嚴2pH363004i―L400544311殘?zhí)?(g/L)i―L2oo753i―L11谷氨酸/(g/L)O0063o0032O6O2O444O4500O22611oOOO2OoOOL兄OOOOoOo>4S5W2s^wiru^m“>->———函“苕殘?zhí)腔蚬劝彼岷?(g/L)殘?zhí)腔蚬劝彼岷?(g/u[■<i 4 6 Cd -O-oc- o c- o c-[-J 4 0COOOOOOOOo嚴500000?iissTLIH6oJTOSiris10009co『值ct1od*od*tlsriim11lMrjpMT即畫存梯度1的發(fā)酵曲線圖10.8°'6營0.4°0.梯度1的發(fā)酵曲線圖10.8°'6營0.4°0.28 11 13 24 27時間/h060梯度2的發(fā)酵曲線8 11 13 24 27時間/h10.80-&埋0.480.20+殘?zhí)呛?■-谷氨酸含量值亠殘?zhí)呛抠锕劝彼岷?0D值2.2討論與分析谷氨酸發(fā)酵中，糖代謝除受到生物素控制外，也受到NH4+的影響。使用生物素缺乏菌，在NH4+存在時，葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸。當NH4+不存在時，糖的消耗速度很慢，生成物是a-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。同時也受到氧、發(fā)酵溫度等因素的影響。對于生物素的要求：1）菌體生長階段保證生物素充足，使菌體快速生長；產(chǎn)酸階段控制生物素亞適量(5-10“g/L)，使谷氨酸大量積累。本實驗中，在相同的培養(yǎng)條件下，蛋白胨培養(yǎng)基的產(chǎn)酸量明顯高于玉米漿梯度培養(yǎng)基，分析原因有以下幾點：生物素的影響在谷氨酸發(fā)酵中，如果能夠改變細胞膜的通透性，使谷氨酸能不斷地排到細胞外面，就能大量積累谷氨酸。研究表明，影響細胞膜通透性的主要因素是細胞膜中的磷脂含量。因此，對谷氨酸產(chǎn)生菌的選育，往往從控制磷脂的合成或使細胞膜受損傷入手，如生物素缺陷型菌種的選育。生物素是不飽和脂肪酸合成過程中所需的乙酰CoA的輔酶。生物素缺陷型菌種因不能合成生物素，從而抑制了不飽和脂肪酸的合成。而不飽和脂肪酸是磷脂的組成成分之一。因此，磷脂的合成量也相應(yīng)減少，這就會導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)不完整，提高細胞膜對谷氨酸的通透性。而本實驗中所用的玉米漿梯度培養(yǎng)基的產(chǎn)酸量較低，可能原因就是因為其生物素含量對菌體的影響不利于菌體產(chǎn)酸，而蛋白胨培養(yǎng)基中生物素含量較低，但并不影響菌體的前期的生長，所以產(chǎn)算量較高；NH4+的影響NH4+的濃度會直接影響到發(fā)酵液的pH，pH值過高或過低都會抑制菌體的生長，從而降低菌體產(chǎn)酸。根據(jù)表2、3、4顯示，玉米漿梯度培養(yǎng)基在發(fā)酵時間為8h和11h時pH至明顯偏高，此時菌體可能被抑制生長，導(dǎo)致最后產(chǎn)酸能力降低。3）由于谷氨酸產(chǎn)生菌是好氧菌，通風(fēng)和攪拌不僅會影響菌種對氮源和碳源的利用率，而且會影響發(fā)酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在發(fā)酵后期，加大通氣量有利于谷氨酸的合成。而在發(fā)酵過程中，要定時測定發(fā)酵液的OD值、殘?zhí)橇亢彤a(chǎn)酸量，而且實驗分組較多（10）,且很多組不在同一時間測定，所以在操作過程中可能導(dǎo)致發(fā)酵液溶氧量不足和溫度不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致菌體生長不充分，抑制菌體產(chǎn)酸。結(jié)果與小結(jié)總的來說，本次實驗基本成功