基因組文庫的構建

第六章DNA文庫的構建和

目的基因的篩選

對于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達數(shù)萬個，且基因組成結構復雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復序列，因此，單個目的基因在整個基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。為了解決這個難題，一種可行的方法就是將這個基因擴增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對它進行特異性擴增，只能構建該生物材料的基因文庫，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來，最后分離得到目的基因。基因組文庫(Genomiclibrary)：是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉化相應的宿主細胞獲得的所有陽性菌落，這個群體就稱為該生物基因組文庫。其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。第一節(jié)基因組DNA文庫的構建一、基因組DNA文庫的類型根據(jù)所選用的載體可以分為：質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。二、基因組DNA文庫的質(zhì)量標準一個理想的基因組DNA文庫應具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選三、基因組DNA文庫構建的程序

①載體DNA的制備；②高純度大相對分子質(zhì)量基因組DNA的提取和大片段的制備；③高純度大相對分子質(zhì)量基因組DNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離；④載體與外源片段的連接與轉化或侵染宿主細胞；⑤重組克隆的挑選和保存。基因組DNA文庫限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉化細菌體外包裝四、生物基因組DNA文庫的構建（一）生物基因組DNA的提取染色體DNA

（二）基因組DNA的不完全酶切1、根據(jù)實驗需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶a)四個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/256b)六個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/10242、分離目的酶切片段大小的確定a)克隆單個基因：<10kbb)克隆基因族：<20kb3、DNA不完全酶切條件的確定a)確定限制酶用量，改變酶切時間b)固定酶切時間，改變限制酶的用量DNA的不完全酶切（三）酶切片段與克隆載體連接１、酶切片段的分離與純化１）低熔點瓊脂糖回收目的片段２）試劑盒回收目的片段2、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇a）質(zhì)粒載體可承載15kbDNA左右片段(有效的范圍為<10kb)b）載體可承載25kbDNA左右片段(有效的范圍為15kb)c）Cosmid載體可承載45kbDNA左右片段(有效的范圍為<40kb)（四）重組ＤＮＡ轉化受體細胞１、根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細胞常見的宿主細胞：DH5

:用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷型的抑制型菌株，可與pUC編碼的－半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)

互補。HB101:用于大規(guī)模制備質(zhì)粒的抑制型菌株，轉化效率高JM101:可支持帶有琥珀突變載體生長的宿主