斑馬魚組織石蠟切片收縮脆裂原因分析

斑馬魚組織石蠟切片收縮脆裂原因分析

由于有很強的繁殖能力、透明的胚胎、短的性、短的個體、易于繁殖等特點，斑馬魚已成為一種被廣泛接受的生物。在藥物篩選、遺傳發(fā)育、環(huán)境毒理及神經科學等方面有諸多的應用。在對斑馬魚的研究中,組織切片技術是運用最多的技術手段。組織切片技術是在組織胚胎學、生理病理學以及細胞生物學中,用來實時觀察組織細胞變化的技術手段,該技術可以克服無法觀察組織內部變化的不足。組織切片是反映組織實時狀況最有效的手段,最接近體內狀況的切片才能最真實地反映出組織的變化。在組織切片中,運用最多的是石蠟切片和冰凍切片。冰凍切片工序簡單,省時,各種抗原丟失少,RNA降解少,但不易得到清晰的組織結構,都會給前期觀察及后期的免疫組化、原位雜交的定位帶來麻煩。石蠟切片則能得到精細清晰的組織細胞結構,對后期免疫組化和原位雜交中信號定位是重要的,并且可以制成永久切片方便進行回顧性研究,不足之處是耗時過長,抗原易失活,RNA易降解。在石蠟切片的制作過程中,固定就是讓組織內的蛋白質、糖類、脂肪等轉變成不溶性物質,同時使附著在組織上的微生物和細胞內的酶失去活性,進而防止組織的自溶,以使得組織與取材之前的結構和狀態(tài)基本一致;脫水就是除去組織內部水分;透明就是將組織內部的脫水劑置換成透明劑(如二甲苯);浸蠟則是以熔融的石蠟置換透明劑,達到組織內部充滿石蠟的目的;最后進入切片染色程序。縱觀整個切片的制作過程,切片最終目的就是使得組織內部充滿石蠟以便于切片。假若組織內的水分不能除盡,則后續(xù)的透明和浸蠟就無法進行;倘若組織內的乙醇未置換完全,也達不到組織內充滿石蠟的要求。以上這2種情況都將導致無法切片。高濃度的乙醇處理時間過長,易引起組織強烈收縮;二甲苯處理時間過長易引起組織的脆裂,因此找出合適的處理時間是改善石蠟切片質量的關鍵所在。筆者以斑馬魚為研究材料,摸索出了一套優(yōu)化石蠟切片的方案,通過優(yōu)化試驗條件,有效降低了組織發(fā)脆和收縮的程度,提高了切片質量,同時也縮短了制片時間。1材料和方法1.1%多聚甲醛磷酸緩沖液pfa成年斑馬魚的心臟、腸、脾臟。固定液為波恩氏液、4%多聚甲醛磷酸緩沖液(PFA),均為新鮮配制。乙醇、二甲苯(宜興市第二化學試劑廠生產,分析純),叔丁醇(上海凌峰化學試劑有限公司生產,化學純)。1.2方法1.2.1脫水、透明程序將3種新鮮的組織分別按照如下步驟進行。分為2組:(1)波恩氏液(新配制)固定12h,70%乙醇(加有1滴濃氨水)洗滌至黃色褪去。脫水、透明程序:70%乙醇1h,80%乙醇1h,90%乙醇1h,95%乙醇1h,無水乙醇1h,無水乙醇-二甲苯等體積混合液0.5h,二甲苯0.5h(各液體用量均為500μL)。(2)4%多聚甲醛緩沖液固定12h,流水沖洗4h,脫水、透明程序同(1)。透明后于57℃浸蠟,共2次,每次1h。包埋,切6μm,HE染色,處理溫度為室溫。1.2.2組織染色時間由于無法通過一些現象來證明組織內的水已經完全脫去了,二甲苯透明這一步卻可以通過組織透明即組織成半透明狀這個現象來判斷最短的透明時間。具體方案是:首先讓組織脫水脫過,得出最短透明時間t;然后,不斷縮短組織的脫水時間,直至組織不能在二甲苯中透明,前一步時間即最短脫水時間t;最后通過切片染色來判斷實際的效果。參考常規(guī)方法,改進后脫水及透明程序為:70%乙醇1min,80%乙醇1min,90%乙醇1min,95%乙醇1min,無水乙醇1min,無水乙醇-二甲苯等體積混合液1min,二甲苯1min,各溶液體積為50μL,處理溫度為室溫。2結果與分析2.1傳統方法試題庫持續(xù)時間的確定從傳統方法的結果中可以看出:心臟和腸都呈現出脆裂的現象(圖1-2、圖2-2),其中小腸絨毛上還出現了“空洞”(圖3-2、圖4-2)。由PFA固定心臟,心室是收縮的(圖1-1、圖1-2)。從改進后的試驗結果可以看出,心臟已基本無脆裂產生(圖1-4、圖2-4),小腸絨毛上已無“空洞”(圖3-4、圖4-4),但心肌纖維還是收縮的(圖1-3、圖1-4)。比較得出,小腸絨毛上的“空洞”是由于脫水過度,而心臟組織上的脆裂是因二甲苯處理時間過長,而并非是組織本身存在的結構。這些現象均與前人研究結論一致,可以將脆裂和收縮作為切片質量的標準。試驗結果說明傳統方法不夠準確,甚至會對組織的結構產生誤判。從試驗時間上看,改進方法的每一步時間均為1min,總時間為7min,而傳統方法的脫水透明時間為6h,相比之下試驗時間極大縮短。在改進過程中,各步驟時間均為1min,但并非最短時間,考慮到更換試劑所需操作時間,將1min設為最短時間。因此對于組織小的脾臟和腸來說,在改進組中也呈現出脆裂現象(圖3-4、圖5-2)。2.2種組織切片切片對肝臟組織及兩理化組織的影響由上述結果可以看出,作為脫水劑的乙醇縮短脫水時間和減少脫水劑的量都已達到極限,即可認定乙醇脫水能力太強。脫水能力指的是在水中的溶解性,即溶解越快脫水能力越強,溶解越慢脫水能力越差。其他常用的脫水劑有正丁醇、叔丁醇、松油醇等,乙醇與水是任意比例互溶;正丁醇微溶于水(20℃溶解度為8.3g),叔丁醇則是溶于水,松油醇幾乎不溶于水,脫水能力由強到弱為乙醇>叔丁醇>正丁醇>松油醇。采用叔丁醇代替乙醇作為脫水劑,對這3種組織進行石蠟切片,脫水及透明程序見表1。試驗結果表明,腸的脆裂現象基本消失(圖6-3),脾臟的還有少許(圖5-2)。對于PFA固定的脾臟而言,組織結構的完整程度較傳統組和改進組高了很多(圖5-1、圖5-2圖、6-5)。在試驗中發(fā)現,經乙醇處理組織會發(fā)生硬化,而叔丁醇處理的組織柔軟,無硬化發(fā)生,減少了組織脆裂的概率。適當選擇脫水能力弱且不硬化組織的脫水劑能進一步改善切片質量。不同的組織脫水透明的時間亦不相同。試驗中,曾將斑馬魚的大腦以乙醇脫水,獲得每一步的時間最短為5min(體積為200μL),因大腦較心臟、腸、脾臟體積大,含水量高,故每一步所需時間長。試劑的體積與組織體積比不能太高,以1mL的體積來脫水透明,則時間可能不到1min,操作上無法實現;試劑體積過高時,小體積的組織放入,則可能很快就與試劑濃度一致,操作上來不及。在實際操作中,均以300μL為最高體積,在隨后的步驟中再慢慢優(yōu)化。既可以節(jié)約時間和試劑,又使得切片質量提高。作為透明劑的二甲苯,處理時間過長易引起組織脆裂,并對試驗人員的身體不利。樓允東等將無水乙醇和二甲苯的步驟改為2~3道松油醇,利用無毒的松油醇的弱脫水能力脫去殘存的約5%水分,同時松油醇又具有透明組織的作用,使得組織脫水和透明同時進行,最后浸蠟,得到了不錯的效果。將斑馬魚心臟用叔丁醇脫水至95%,接著放入松油醇,透明時間也很短,獲得了很滿意的結果。2.3文化樣品的檢測固定劑PFA和波恩氏液作用效果也不一樣。經PFA磷酸緩沖液固定的心臟和腸,較波恩氏液收縮的特別明顯(圖1-1、圖1-3、圖2-1、圖2-3、圖3-1、圖3-3、圖4-1、圖4-3),其中心室的心肌纖維分散,整體不完整(圖1-2、圖1-4、圖2-2、圖2-4);而小腸絨毛之間不緊湊(圖3-1、圖3-3、圖4-1、圖4-3),每個絨毛的黏膜肌分散,與心肌的情況類似。研究認為,經甲醛固定的組織再由乙醇脫水會引起強烈的收縮,于是改換不會引起收縮的叔丁醇作為脫水劑。從圖2-1、圖2-3可以看出,由叔丁醇脫水的組織還是導致了心肌纖維和小腸絨毛的收縮,繼而將脫水劑更換為脫水能力更弱的松油醇,結果還是引起了收縮,表明引起這類收縮與脫水劑無關。結果可以看出,若只是觀察組織形態(tài),波恩氏液固定優(yōu)于PFA。而石蠟切片不僅應用于觀察組織變化,同時也運用于免疫組化(IHC)和原位雜交(ISH),因此切片質量的好壞將影響到最后結果的判定。免疫組化和原位雜交的固定液基本上都是PFA磷酸緩沖液,對于斑馬魚心臟這類組織來說,最好是應用冰凍切片技術(圖7)。對于信號以細胞核定位的免疫組化和原位雜交來說,固定液采用波恩氏液不是最理想,經其固定后的組織不一定有信號,推