大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)及發(fā)酵技術(shù)

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)的概述動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)：無(wú)細(xì)胞壁倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢需氧量少，對(duì)攪拌敏感聚集體形成原代細(xì)胞培養(yǎng)50代即開(kāi)始退化動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的定義：動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適溫和豐富的營(yíng)養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概述生長(zhǎng)特性貼壁生長(zhǎng)型：如人胚肺細(xì)胞，Hela細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)型：如血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本技術(shù)體外培養(yǎng)特點(diǎn)體外培養(yǎng)工具體外培養(yǎng)條件體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程培養(yǎng)方法大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)體外培養(yǎng)的特點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)條件苛刻適應(yīng)性差，敏感培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，易污染體外培養(yǎng)的條件溫度，37℃pH：7.2-7.4氣體：氧，二氧化碳，氮?dú)鉅I(yíng)養(yǎng)條件：需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長(zhǎng)因子，其中多種成分可由血清提供細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)容易換液，不需特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可采用灌流培養(yǎng)獲得高密度，但擴(kuò)大規(guī)模較難，適合制備量小，價(jià)值高的生物藥品。（CelliGenPlusTM）微載體培養(yǎng)最有前途的動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，兼有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，易于放大。（Cytodex，Cytopore和Cytoline）無(wú)血清懸浮培養(yǎng)用已知人源或動(dòng)物來(lái)源的蛋白或激素代替動(dòng)物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中重要參數(shù)pH溶氧溫度谷氨酸/谷氨酰胺葡萄糖乳酸CO2動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中重要參數(shù)NH4+K+/Na+Ca++滲透壓細(xì)胞密度動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)存在的問(wèn)題細(xì)胞凋亡細(xì)胞在高密度條件下，由于細(xì)胞的多層生長(zhǎng)，存在細(xì)胞接觸抑制效應(yīng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)和表達(dá)均受到嚴(yán)重影響動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)存在的問(wèn)題細(xì)胞凋亡主要是細(xì)胞生長(zhǎng)的條件較惡劣，包括：1.營(yíng)養(yǎng)缺乏2.有害代謝產(chǎn)物的積累3.pH和溶氧控制不當(dāng)4.機(jī)械攪拌剪切力較大5.滲透壓細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用生產(chǎn)疫苗蛋白質(zhì)和多肽藥物基因治療單抗微生物培養(yǎng)技術(shù)概述傳統(tǒng)：釀酒、抗生素、制醋基因工程：生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物、疫苗等（大腸桿菌、酵母）一般采用高密度發(fā)酵技術(shù)微生物培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程決定于：菌種培養(yǎng)條件

微生物培養(yǎng)過(guò)程重要參數(shù)：溫度pH溶氧葡萄糖/甘油乙酸

乳酸NH4+磷酸鹽乙醇(酵母)甲醇(酵母)細(xì)胞密度微生物高密度培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基表達(dá)基因的調(diào)控宿主菌質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性

高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵是發(fā)酵的補(bǔ)料控制,根據(jù)重組菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)及產(chǎn)物的表達(dá)方式采取合理的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流加方式恒速流加變速流加指數(shù)流加

微生物高密度培養(yǎng)乙酸的形成:培養(yǎng)液中葡萄糖的含量超過(guò)菌體生長(zhǎng)所需量或在缺氧的情況下,便會(huì)大量產(chǎn)生乙酸.減少乙酸的策略:限制性流加葡萄糖甘油代替葡萄糖降低培養(yǎng)溫度

宿主菌降低比生長(zhǎng)速率透析培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵中的重要參數(shù)了解生物技術(shù)的應(yīng)用GlucoseGlutamineAmmoniaLactatepH不同的細(xì)胞具有不同最佳pH范圍pH能影響葡萄糖和谷氨酰胺的代謝，在低pH條件下，葡萄糖消耗速度慢

pH能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物的量

CO2在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，CO2

與碳酸氫鹽形成緩沖對(duì)，穩(wěn)定培養(yǎng)液中的pHCO2也可用于計(jì)算呼吸商，反應(yīng)細(xì)胞活力和代謝旺盛程度細(xì)胞代謝（呼吸作用）會(huì)產(chǎn)生CO2(廢物)CO2

水平增加會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活性，從而影響目標(biāo)蛋白的表達(dá)，當(dāng)溶液中CO2達(dá)到14-15%時(shí)，會(huì)嚴(yán)重抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)CO2+H2O<<>>H2CO3<<>>H++HCO3-DO(溶氧）葡萄糖等需氧來(lái)氧化產(chǎn)生ATP供細(xì)胞的能量用于測(cè)量和跟蹤細(xì)胞消耗氧的速率.

溶氧在細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵過(guò)程中，O2通常是限制營(yíng)養(yǎng)成分，是因?yàn)樗谌芤褐械腿芙舛?通常關(guān)心對(duì)培養(yǎng)液中%O2,也就是“溶氧”值(DO):理論DO:80%+/-5%(哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))>90%DO2(細(xì)菌培養(yǎng)）O2也可能通過(guò)自由基形成對(duì)細(xì)胞造成傷害,在低pO2

水平，細(xì)胞的活性通常越高

(O2值必須維持在最低的水平)然而,原代細(xì)胞可能在低O2

條件下繁殖受延遲

因而，維持正確的O2的平衡，對(duì)保證所有細(xì)胞正確生長(zhǎng)都非常重要,一般30-50%葡萄糖葡萄糖兩個(gè)主要的功能:細(xì)胞的主要的能量物質(zhì)主要的細(xì)胞碳源

葡萄糖和谷氨酰胺是相互補(bǔ)充的:產(chǎn)生其他代謝物(例如:天冬氨酸)提供能量在所有細(xì)胞中通過(guò)糖酵解途徑轉(zhuǎn)變成丙酮.

葡萄糖的代謝隨細(xì)胞生長(zhǎng)而增加.葡萄糖通常是細(xì)胞生長(zhǎng)的限制因素葡萄糖監(jiān)控細(xì)胞反應(yīng)器和發(fā)酵罐中的葡萄糖水平:保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)所需能量.開(kāi)發(fā)延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)周期的標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料策略.計(jì)算葡萄糖消耗速率和決定批次培養(yǎng)最佳的起始濃度.乳酸=氧化問(wèn)題在培養(yǎng)過(guò)程中，大多數(shù)乳酸來(lái)自于葡萄糖代謝，但也有一部分來(lái)自于谷氨酰胺代謝.基于高細(xì)胞密度和深液位，氧的消耗非常大.典型的范圍(組織培養(yǎng)):0-5g/LO2

消耗導(dǎo)致乳酸的形成，最終導(dǎo)致pH的下降.對(duì)恒定的pH:抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的乳酸水平在低到4mM到高達(dá)70mM(取決于細(xì)胞).在大多數(shù)情況下，銨對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制比乳酸更嚴(yán)重.乳酸監(jiān)控長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞培養(yǎng)中乳酸的積累.計(jì)算乳酸產(chǎn)量與葡萄糖的消耗之間的代謝關(guān)系考察乳酸鹽對(duì)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的毒害影響銨細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵中銨的來(lái)源:主要來(lái)源:代謝谷氨酰胺(谷氨酰胺降解)谷氨酰胺降解成銨和吡咯烷酮酸其他氨基