基因工程第五章-載體

Chapterfive

vectorsAgricultureuniversityofHebeiProvince載體的概念：載體是基因工程中攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，可自我或隨同宿主DNA的復(fù)制而復(fù)制，及表達(dá)的工具。載體的條件：含有復(fù)制子：這是一段具有特殊結(jié)構(gòu)的DNA序列，載體有復(fù)制起始位點(diǎn)，才能攜帶外源基因進(jìn)入宿主后，進(jìn)行復(fù)制，保證子代細(xì)胞仍含有外源基因。有一個或多個利于檢測的遺傳表型，易于識別和篩選。如抗藥性、顯色表型、營養(yǎng)缺陷型、熒光表型等.有一個或幾個限制性酶切酶的單一識別位點(diǎn)，便于外源基因的插入。適當(dāng)?shù)目截悢?shù)。高拷貝數(shù)不僅利于載體的制備，也有利于克隆基因的劑量的增加。載體的分類：質(zhì)粒載體――可容納15KB的外源片斷噬菌體載體――25－45KB

人工染色體－－45KB以上質(zhì)粒是一種可進(jìn)行自我復(fù)制的并能獨(dú)立傳播的DNA的一種存在形式，并且自然界中原核生物、真核生物大部分都發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在，所以質(zhì)粒現(xiàn)在是應(yīng)用最廣的載體plasmidsSectionone一、質(zhì)粒的生物學(xué)特性：質(zhì)粒最初發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中，是染色體外能自主復(fù)制的雙鏈共價閉合的環(huán)狀DNA分子，是能夠進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制并保持遺傳恒定的復(fù)制子，大小在1――200KB。質(zhì)粒常含有一些編碼對細(xì)菌生存有利的基因，比如說抗性基因，降解復(fù)雜有機(jī)物的酶、細(xì)菌素，并且可賦予微生物特殊的外形―――鞭毛、菌毛、芽孢等。

如:大腸桿菌中的F質(zhì)粒、R質(zhì)粒、COL質(zhì)粒。F質(zhì)粒：又叫性質(zhì)粒，他的存在決定大腸桿菌的性別，含有F因子的菌株有一個特殊的結(jié)構(gòu)――性菌毛。R質(zhì)粒：又叫抗性因子，他們含有一種或幾種抗生素的抗性基因，編碼一些酶類，可對抗生素進(jìn)行修飾和降解。這樣一旦微生物具有了抗性質(zhì)粒，就出現(xiàn)對抗生素的抗性。1959－1960年日本人發(fā)現(xiàn)了抗藥性因子。另外除了抗藥特點(diǎn)外，有的質(zhì)粒具有抗砷、汞、銀等重金屬的特性，有的抗紫外等射線。COL質(zhì)粒：1952年發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌含有這一因子可編碼一種奇怪的蛋白質(zhì)抗菌物質(zhì)――大腸菌素。如何識別微生物是不是含有質(zhì)粒？首先要看微生物的形態(tài)（同種微生物形態(tài)不同，可能含有），其次要從細(xì)胞中提取質(zhì)粒。如熒光假單孢菌。具有質(zhì)粒的均有分泌抗生素的特性。二、質(zhì)粒的遺傳學(xué)特性：1.質(zhì)粒DNA閉合的環(huán)狀分子：迄今發(fā)現(xiàn)的大部分質(zhì)粒都是環(huán)狀分子，也有線性的。質(zhì)粒分子三種存在形式：（主要與復(fù)制有關(guān)）共價閉合超螺旋形式：（covalentlyclosedcircular，簡寫cccDNA）開放環(huán)結(jié)構(gòu)：一條保持著完整的環(huán)結(jié)構(gòu)，另一條有一個或數(shù)個切刻。線性結(jié)構(gòu)：質(zhì)粒在限制性酶作用下，雙鏈斷裂，形成線性，又叫L型。

克隆只有超螺旋可用。2.cccDNA分子分離特性：由于cccDNA分子團(tuán)壓成一個緊密的結(jié)構(gòu)，當(dāng)我們用EBr、丫啶橙染料分子作用后，線性分子染料插入的分子個數(shù)多，cccDNA插入的分子個數(shù)少，密度大，所以沉降系數(shù)大，進(jìn)行密度梯度離心時可將其分開cccDNA在較高高的溫度和PH值條件下才會變性，（較線性和開放環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA），如果變性，由于團(tuán)在一起，條件恢復(fù)后，會很快復(fù)性，形成cccDNA，線性和環(huán)狀的變性后，復(fù)性會形成雜亂的大分子團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，從而從體系中沉淀下來。3.質(zhì)粒DNA的分子量和拷貝數(shù)：按質(zhì)粒的分子量大小，可分為量大類：3――7kb，拷貝數(shù)多；70－150kb，含有與質(zhì)粒功能有關(guān)的更多基因，可自我傳遞（可編碼一套控制質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移的基因，所以可從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)到另一個細(xì)胞），如果一個細(xì)胞含有這種質(zhì)粒，他可以帶動小質(zhì)粒進(jìn)行傳遞轉(zhuǎn)移。這種質(zhì)粒的拷貝數(shù)低。

拷貝數(shù)是受一個定位在叫cop基因編碼的阻遏物的控制，質(zhì)粒個數(shù)增加，合成的阻遏物的濃度增加，從而阻止質(zhì)粒的進(jìn)一步合成。不像病毒DNA進(jìn)行無限制的合成，直到細(xì)胞裂解。4.質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型：根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制所受控制的方式和在寄主細(xì)胞所含質(zhì)?？截悢?shù)的多少：松弛型：質(zhì)粒的復(fù)制可自由完成，自身可編碼與復(fù)制有關(guān)的功能蛋白，所以在細(xì)胞的生命周期中，可隨時進(jìn)行自我復(fù)制，所以松弛型的拷貝數(shù)多，每個細(xì)胞中由10－200個不等。嚴(yán)緊型：質(zhì)粒的復(fù)制的啟動，受寄主細(xì)胞的復(fù)制起始蛋白的調(diào)控，復(fù)制起始蛋白是細(xì)胞在進(jìn)行DNA復(fù)制時產(chǎn)生的，所以嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制是宿主細(xì)胞進(jìn)行染色體復(fù)制時才能進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒，依賴于宿主細(xì)胞，自身不能合成復(fù)制起始蛋白。他隨染色體可平均分配到子細(xì)胞中?？截悢?shù)少1－2個。5.質(zhì)粒的提取與純化：原理：理想的狀態(tài)是細(xì)胞裂解后，大部分DNA釋放到裂解液中，根據(jù)共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA在pH12-12.5時，線性DNA會完全變性，而共價閉合環(huán)狀的DNA只是氫鍵斷裂，酸中和后，共價閉合環(huán)狀的DNA迅速準(zhǔn)確地復(fù)性，而線性DNA聚合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白和RNA一道離心沉淀，上清液中的質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀出來。第一步：（1）在5m1含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中接種一單菌落，于37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。（2）將1.5m1培養(yǎng)物倒入Eppendorf管中，用微量離心機(jī)于4℃以12000rpm離心30秒。（3）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。（4）將細(xì)菌沉淀重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液I中（溶液Ⅰ：50mmol／L葡萄糖，25mmol／LTris·CI(pH8．0)，10mmol／LEDTA(pH8．0，溶菌酶4－5mg，酶作用環(huán)境由緩沖液提供)。劇烈振蕩。須使細(xì)菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分散，將兩個微量離心管的管底部互相接觸，室溫靜止5－30min，細(xì)胞壁降解。第二步：加200μl新配制的溶液Ⅱ（現(xiàn)用現(xiàn)配）（0.2mol／LNaOH，1％SDS）．蓋緊管口，快速顛倒離心管，以混合內(nèi)容物冰浴5min。SDS破壞原生質(zhì)體，然后DNA變性。時間是關(guān)鍵：長了變性不可逆，短了DNA沒有變性。此時的現(xiàn)象應(yīng)為變得澄清，和鼻涕一樣粘。第三步：加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ（5mol／L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，pH為4.8）。蓋緊管口，溫和地振蕩10秒鐘使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3—5分鐘。中和作用使DNA形成網(wǎng)狀的聚合物，高濃度的乙酸鉀會引起蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物變性和大分子RNA共同沉淀。最后：4℃12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，上清中是質(zhì)粒DNA。加等體積氯仿，振蕩混勻，4℃12000rpm離心10分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。用2倍體積的無水乙醇沉淀雙鏈DNA。溫和振蕩混勻，于-18℃放置20分鐘。用微量離心機(jī)于4℃以12000rpm離心10分鐘。棄上清，加入70%冷乙醇洗沉淀1-2次真空干燥DNA沉淀后，將其溶于TE溶液中。

6.影響質(zhì)粒產(chǎn)量的因素：寄主自身的遺傳背景：質(zhì)粒一般都保藏在質(zhì)粒中，所以質(zhì)粒的穩(wěn)定性直接與寄主的特性有關(guān)，我們在基因工程中采用的寄主細(xì)胞都是經(jīng)過人為改造過得微生物，如JM110，JM109、XL1-Blue等，這些菌株的end基因均發(fā)生了突變，end基因負(fù)責(zé)編碼核酸內(nèi)切酶I，突變后，菌株就失去了編碼能力，從而保證了質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在。所以，我們要想獲得大量的質(zhì)粒DNA，最好不要選擇野生型菌株作為宿主細(xì)胞。質(zhì)粒的拷貝數(shù)：分子的多與寡是決定產(chǎn)量的重要因素。

pBR322拷貝數(shù)大于25個產(chǎn)量0.23ug/mlColE115個0.11ug/ml基因克隆盡量選擇松弛型質(zhì)粒，如果是嚴(yán)緊型要進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制子改造。質(zhì)粒的大小：通常質(zhì)粒越大，拷貝數(shù)也越少，所以我們在進(jìn)行基因重組時，首先要選擇分子量小的質(zhì)粒，其次質(zhì)粒分子量大的要使外源基因的片斷長度合適，不要過大。三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建天然質(zhì)粒存在著不同程度的局限性，不能直接作為基因克隆的載體，必須進(jìn)行改造。便于轉(zhuǎn)化、篩選。

質(zhì)粒的構(gòu)建有三個方面：1.引入易于檢測的選擇性標(biāo)記，去掉質(zhì)粒的非必需序列：最早使用的質(zhì)粒載體只有一個選擇性標(biāo)記：抗性基因（一個標(biāo)記有局限性：無法知道外源基因是不是轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，因為空載體也可使菌株產(chǎn)生抗性）。第一個經(jīng)改造的認(rèn)為較完善的質(zhì)粒載體是pBR313,他是松弛型載體，引入了兩個標(biāo)記基因------抗四環(huán)素基因Tecr和抗青霉素基因Ampr,他的外源基因插入位點(diǎn)在兩個抗性基因中

質(zhì)粒的序列含有必要區(qū)和非必要區(qū)。必要區(qū)指的是與質(zhì)粒DNA復(fù)制有關(guān)的基因，他們對質(zhì)粒的存活、復(fù)制極為重要。非必要區(qū)里存在著影響細(xì)胞性狀的基因，編碼產(chǎn)生特殊的物質(zhì)，另外還有一部分質(zhì)粒片斷至今不知其功能。必要和非必要區(qū)各自獨(dú)立，所以我們可以把非必要區(qū)去除，只留下必要區(qū)。

2.調(diào)整質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)，引入多克隆位點(diǎn)：新型載體都引入了一個人工合成的由多種常用限制性內(nèi)切酶單一識別位點(diǎn)組成的序列，叫多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsite,MCS

）。

3.引入多種用途的輔助序列，構(gòu)建具有特化功能的載體：構(gòu)建質(zhì)?？捎糜诮M織化學(xué)方法的鑒定：pUC18載體帶有一個Lac操縱子的DNA區(qū)段，宿主細(xì)胞具有與之互補(bǔ)的基因，當(dāng)質(zhì)粒進(jìn)入宿主后，由于互補(bǔ)作用，而實現(xiàn)β－半乳糖苷酶的表達(dá)（誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，阻遏蛋白與操作子脫離）。外源基因的插入會導(dǎo)致基因失活而檢查重組子。

構(gòu)建可對重組克隆進(jìn)行選擇的質(zhì)粒載體，這種質(zhì)粒載體具有直接選擇標(biāo)記并可賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型（熒光蛋白）。

構(gòu)建含有強(qiáng)啟動子的表達(dá)型質(zhì)粒載體，很多質(zhì)粒載體在多克隆位點(diǎn)的臨近位置上帶有外源啟動子，插入的外源基因可以表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。四、典型的質(zhì)粒載體1.pBR322：pBR322是按照標(biāo)準(zhǔn)的載體命名原則命名，p表示質(zhì)粒plasmid，BR分別是質(zhì)粒的兩位構(gòu)建人bolivar和rodriguez,322指實驗室編號。優(yōu)點(diǎn)：具有較小的分子量:經(jīng)驗表明為了避免DNA分子在純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體最好不要超過10kb，pBR322不僅易于分離純化，而且即使克隆一段大小達(dá)6kb的外源DNA后，其重組體分子的大小仍符合這一條件。有兩種抗生素抗性基因，可作為轉(zhuǎn)化子的選擇性標(biāo)記。當(dāng)我們把目的基因插入到抗性基因內(nèi)部，抗性基因就會失去活性，即不能進(jìn)行抗性蛋白物質(zhì)的合成，就為我們篩選提供一種標(biāo)記。

具有較高的拷貝數(shù)，我們用氯霉素（壯觀霉素）處理后，質(zhì)粒