基因工程(基因工程的主要技術(shù)與原理-分子雜交技術(shù))

基

因

工

程生物技術(shù)專業(yè)核心課程E基因的化學(xué)合成C分子雜交技術(shù)

A核酸的分離和純化B核酸電泳3.基因工程的主要技術(shù)及原理FPCR技術(shù)DDNA核苷酸序列分析第三節(jié)分子雜交技術(shù)(molecularhybridizationtechnique)分子雜交:是分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用于檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)分子是否存在，以及其分子量的大小。根據(jù)其檢測對象的不同可分為Southern雜交、Northern雜交和Western雜交，以及由此而簡化的斑點雜交、狹線雜交和菌落雜交等。一、基本原理帶有互補核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)，形成雜種核酸分子。能形成雜種分子的不同DNA或RNA分子，其親緣關(guān)系較為密切，反之其親緣關(guān)系則比較疏遠。當用一個標記的核酸分子與核酸樣品雜交,便可查明該樣品中是否存在與該標記核酸分子具有同源性的核酸分子。這個標記的核酸分子稱為探針(probe)，可以是DNA，也可以是RNA，或合成的寡核苷酸。1、核酸印跡（Nucleicacidblotting):

將核酸樣品（DNA、RNA或蛋白質(zhì)）在凝膠上分離，然后將樣品通過影印的方式轉(zhuǎn)移到固相支持物如濾膜上。二、基本過程2、核酸雜交（Hybridization):

將已印跡有核酸樣品的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針(Probe)進行雜交。3、結(jié)果檢測（DetectionResults):

通過放射自顯影或顯色反應(yīng)，判斷樣品中是否有與探針同源的核酸分子或與抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)分子。核酸印跡的方式：電泳凝膠核酸印跡法(Southern/Northernblot)斑點印跡法(Dotblot)菌落或噬菌斑印跡法(Colony/Plaqueblot)三、Southernblothybridization1、原理：

通過毛細管作用、電轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)膜等方法，使在凝膠電泳中已分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合到適當?shù)臑V膜上，然后通過同已標記的單鏈DNA或RNA探針進行雜交，以檢測被轉(zhuǎn)移DNA片段，稱為DNA印跡雜交技術(shù)。在1975年，由英國的E.Southern首先設(shè)計發(fā)明的，因此又稱為Southern雜交（Southernblotting)。2、特點：作用對象：DNA分子DNA片段需經(jīng)凝膠電泳分離固相支持物：可選用的濾膜種類較多靈敏度高3、基本過程：DNA的片段化及其電泳分離凝膠電泳后的變性處理轉(zhuǎn)移并固定到濾膜上雜交檢測與分析TheSouthernblottingtechnique1）DNA的片段化及其電泳分離2）凝膠電泳后的變性處理在0.4NNaOH堿性條件下變性，使雙鏈DNA分子變成單鏈。再在1.5MNaCl/1MTris（pH7.4）條件下中和使DNA仍保持單鏈狀態(tài)。

凝膠3）轉(zhuǎn)移并固定到濾膜上通過毛細管滲吸或電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移的方式，將凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。最后通過80℃處理或紫外線照射將DNA固定在濾膜上。Southernblotting裝置示意圖4）探針的制備及雜交預(yù)雜交：將結(jié)合了DNA分子的濾膜先與特定的預(yù)雜液進行預(yù)雜交，也就是將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對探針的吸附。探針標記與目的序列同源的核苷酸片段作為探針；雜交：在一定的溶液條件和溫度下，將標記的核酸探針與濾膜混合，如果濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸在濾膜上。65

C雜交12-16hr

洗膜：經(jīng)過一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探針分子除去。安裝雜交管雜交爐5）檢測與分析通過放射自顯影或生化檢測，就可判斷濾膜上是否存在與探針同源的DNA分子及其分子量。

Southern雜交主要用來判斷某一生物樣品中是否存在某一基因，以及該基因所在的限制性酶切片段的大小。（DNA水平）Southern雜交也可檢測目的基因的拷貝數(shù)。12345CKSouthernbloting1、原理：根據(jù)毛細管作用的原理，使在凝膠電泳中已分離的RNA轉(zhuǎn)移并結(jié)合到適當?shù)臑V膜上，然后通過同已標記的單鏈DNA或RNA探針進行雜交，以檢測被轉(zhuǎn)移RNA片段，稱為RNA印跡雜交技術(shù)。在1979年，由J.C.Alwine等人設(shè)計。也稱為Northern雜交（Northernblo