中和實(shí)驗(yàn)方法

RSV特異性中和抗體滴度檢測一、 實(shí)驗(yàn)原理：抗體與相應(yīng)的病毒粒子特異地結(jié)合，使后者失去對(duì)易感動(dòng)物或細(xì)胞的致病力。（該試驗(yàn)方法以測定抗病毒血清的中和價(jià)，將待檢血清2倍遞增稀釋，加等量已知毒價(jià)的病毒液。）二、 實(shí)驗(yàn)分類：固定血清--稀釋病毒中和試驗(yàn)固定病毒一稀釋血清中和試驗(yàn)簡單定性中和試驗(yàn)空斑減少法三、 實(shí)驗(yàn)步驟：提前設(shè)定56°C水浴鍋，將分裝好的待測血清于56°C滅活（降低補(bǔ)體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響）30min。將加過雙抗的培養(yǎng)基DMEM/F-12（用于Hep-2細(xì)胞；Vero細(xì)胞常用DMEM培養(yǎng)基）和BI血清進(jìn)行37C預(yù)熱30min，與此同時(shí)滅好實(shí)驗(yàn)臺(tái)（該準(zhǔn)備3599細(xì)胞培養(yǎng)板滅過菌槍頭以及15ml和50ml搖菌管）為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)臺(tái)滅菌30min，滅好臺(tái)子后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先取1.5mlEP管，用DMEM/F-12培養(yǎng)基8倍稀釋待測血清（每管中加培養(yǎng)基210^1，再加相應(yīng)的血清30見），拆開96孔培養(yǎng)板后在蓋子進(jìn)行設(shè)計(jì)（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參考圖1），最后向每孔中加入75^1的培養(yǎng)基，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)的稀釋血清75^1，用排槍以兩倍梯度稀釋血清。（注意：最終到256倍時(shí)吸出的多余的75^1血清并棄掉。）實(shí)驗(yàn)孔以及陽性對(duì)照孔分別每孔加入25m（注意：加毒時(shí)應(yīng)從血清低濃度到高濃度）的104TCID5O病毒混勻，4°C孵育2h。在實(shí)驗(yàn)剩余半小時(shí)左右進(jìn)行消化細(xì)胞，鏡檢細(xì)胞匯合度為90%左右即可用，棄掉培養(yǎng)液后，用2-3ml無血清培養(yǎng)吹洗幾遍細(xì)胞（意圖為去除死細(xì)胞或活性不好的細(xì)胞），加入2ml胰酶后開始計(jì)時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37^的CO2無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)消化2-3min，在鏡檢細(xì)胞間有間隙或細(xì)胞收縮為單個(gè)狀態(tài)為好，加入等體積的無血清培養(yǎng)基終止，小心吸掉液體，加入有血清的培養(yǎng)基2-3ml輕輕地吹下皿底部的細(xì)胞，輕微用槍吹吸幾次使其成為均勻的單細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)移到新的15ml離心管中等待細(xì)胞計(jì)數(shù)。經(jīng)過計(jì)數(shù)和相應(yīng)的稀釋后使得細(xì)胞濃度為105個(gè)/ml。最后加入104個(gè)Hep-2細(xì)胞（或1.5*104個(gè)Vreo細(xì)胞）100pl，將細(xì)胞鋪好后于37C的CO2無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)。注意：使用細(xì)胞一般為5代以內(nèi)，培養(yǎng)的細(xì)胞匯合度為90%左右即可用。培養(yǎng)72h后棄掉培養(yǎng)基，用PBST洗板3次，然后加入80%丙酮-PBS溶液（v/v）在4C冰箱固定15min，將孔內(nèi)的液體棄掉，室溫干燥。加入質(zhì)量體積比為5%BSA（或5%脫脂奶粉）封閉，37C放置2h，棄掉廢液后用PBST洗板3次，用力拍板數(shù)次使得孔內(nèi)無水珠。使用2%BSA（或2%脫脂奶粉）將山羊抗RSV的多克隆抗血清稀釋4000倍，加入每孔100pl后37C放置1h，PBST洗板5次，用力拍板數(shù)次使得孔內(nèi)無水珠。使用2%BSA（或2%脫脂奶粉）將HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的抗山羊IgG的多克隆抗血清稀釋4000倍，加入每孔100pl后37C放置1h，PBST洗板6次，再次用力拍板數(shù)次使得孔內(nèi)無水珠。每孔加入100plTMB顯色液，于37C顯色5min。每孔加入100pl的2moL/L的硫酸終止液，于OD450/620nm測定每孔的光密度值。中和抗體滴度的判斷以低于陽性的50%光密度值為依據(jù)。試劑的配方：PBST的配方：0.05%Tween20溶于PBS（PH=7.4左右），TMB顯色液配方：100見的TMB（10mg/ml）；4.4ml的磷酸氫二鈉溶液（0.2M）5.6ml的檸檬酸溶液（0.1M，用1MNaOH調(diào)節(jié)至ljPH=5）1pl30%的過氧化氫溶液注意：實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞代數(shù)，和培養(yǎng)細(xì)胞的匯合度都得統(tǒng)一，感染復(fù)數(shù)MOI（平均每個(gè)細(xì)胞侵染病毒的個(gè)數(shù)）為1：1左右，TCID50含義：將該病毒稀釋106.5接種100pl可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。PFU:（Plaqueformingunit）空斑形成單位，感染性滴度的單位一般為PFU/mloMOI:（Multiplicityofinfection）感染復(fù)數(shù)；傳統(tǒng)的感念起源于噬菌體感染細(xì)菌的研究，含義為感染時(shí)噬菌體與細(xì)菌的數(shù)量比值，也