基因編輯治療行業(yè)研究：生物醫(yī)學(xué)的明珠基因編輯逆轉(zhuǎn)先天缺陷

基因編輯治療行業(yè)研究：生物醫(yī)學(xué)的明珠，基因編輯逆轉(zhuǎn)先天缺陷科學(xué)原理：認(rèn)識(shí)DNA——DNA缺陷伴隨一生且可能影響后代什么是DNA？了解基因疾病、遺傳疾病前，首先需要了解致病機(jī)理發(fā)生的物質(zhì)——DNA。脫氧核糖核酸（DNA）是人類存儲(chǔ)遺傳信息的物質(zhì)。DNA通常由2條DNA鏈形成互相纏繞的雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA的基本組成單位是4種核苷酸：腺嘌呤（Adenine，A）、胸腺嘧啶（Thymine，T）、胞嘧啶（Cytosine，C）、鳥(niǎo)嘌呤（Guanine，G）。每個(gè)核苷酸由3部分組成：磷酸基、五碳糖、堿基。4種核苷酸的堿基不同。單個(gè)DNA鏈之間的核苷酸由五碳糖和磷酸基之間的共價(jià)鍵相連，2個(gè)鏈條間則由堿基之間的氫鍵相互吸引，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。2個(gè)堿基通過(guò)氫鍵相連的現(xiàn)象被稱為堿基配對(duì)。堿基配對(duì)（basepairing）中A與T配對(duì)，C與G配對(duì)。DNA如何影響我們？DNA通過(guò)蛋白控制影響著身體的活動(dòng)和表征。DNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的過(guò)程分為兩大步，第一步：DNA轉(zhuǎn)化為mRNA，這一步驟稱為轉(zhuǎn)錄（transcription），發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)；第二步：mRNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，這一步驟稱為轉(zhuǎn)譯（translation），發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。mRNA是DNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的中間體，這也是它名稱的由來(lái)，即信使RNA（messengerRNA）。通俗來(lái)講，DNA類似于底稿，DNA發(fā)生的改變會(huì)一直存在于體內(nèi)，由此細(xì)胞分裂新產(chǎn)生的細(xì)胞也會(huì)繼承這些改變，因此DNA的改變有很大概率會(huì)伴隨一生，其中性細(xì)胞中DNA的變化甚至能夠遺傳至下一代。同時(shí)部分DNA片段會(huì)影響mRNA產(chǎn)生的速率與表達(dá)量。mRNA類似于說(shuō)明書(shū)，能夠指導(dǎo)自身細(xì)胞生產(chǎn)出特定的蛋白。蛋白則是最終生產(chǎn)得到的工具，對(duì)生物個(gè)體的各項(xiàng)指標(biāo)直接產(chǎn)生作用。mRNA或蛋白的變化不會(huì)被繼承或遺傳。這一條轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯鏈被稱為生物學(xué)“中心法則”（TheCentralDogma）。DNA與基因疾病和遺傳性疾病根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究院的定義，遺傳性疾?。╤ereditarysyndrome）通常指部分或完全由具有遺傳性的基因或染色體異常導(dǎo)致的疾病。根據(jù)美國(guó)國(guó)家人類基因研究院的定義，基因疾?。╣eneticdisorder）指完全或部分由于DNA序列異常導(dǎo)致的疾病。遺傳性疾病和基因疾病雖然不完全相同，但包含了很多重疊的病癥。DNA作為人類遺傳物質(zhì)的存儲(chǔ)載體，深藏在細(xì)胞核中。一方面受到細(xì)胞結(jié)構(gòu)和人體免疫機(jī)制的層層保護(hù)，不易發(fā)生改變；但另一方面，在出現(xiàn)基因異常時(shí)，現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)技術(shù)也難以提供有效的治療方案。同時(shí)，DNA異常通常會(huì)伴隨患者一生，且有很大幾率遺傳至后代。因此，患者疾病負(fù)擔(dān)大，且缺乏有效的治療手段。除此之外，許多罕見(jiàn)病是由基因缺陷造成的。大部分具有缺陷的基因，會(huì)導(dǎo)致基因的攜帶者難以生存。由于基因是遺傳信息載體，因此在長(zhǎng)時(shí)間的自然選擇中，這類基因難以被繼承，所以許多基因疾病/遺傳疾病都屬于未被滿足的醫(yī)療需求。工程原理：基因編輯——精準(zhǔn)定位、永久修正精確定位是基因編輯的核心基因編輯工具使人類擁有了定向改變DNA或RNA的能力。通過(guò)插入、刪除、替代特定位點(diǎn)的核苷酸，我們能夠改變基因表達(dá)，進(jìn)而長(zhǎng)久地影響蛋白序列或結(jié)構(gòu)。援引發(fā)表在YaleJournalofBiologyandMedicine上的文章“GenomeEditing:Past,Present,andFuture”的內(nèi)容，歷史上，人類不斷探索能夠改變基因的方式。在20世紀(jì)時(shí)，人類曾通過(guò)化學(xué)療法、放射療法改變腫瘤細(xì)胞的DNA，擾亂腫瘤細(xì)胞的生命活動(dòng)，以此消滅腫瘤。但這2種方法造成的基因變化是隨機(jī)的，且難以精準(zhǔn)定位。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)明了3種重要的基因編輯工具：鋅指（ZFN）、TALEN、CRISPR。現(xiàn)代基因編輯工具的出現(xiàn)不僅大大加速了科學(xué)研究，同時(shí)也給許多基因疾病的治療帶來(lái)的可能性。精準(zhǔn)定位是基因編輯的重要能力，是實(shí)現(xiàn)定向編輯的第一步。靶向特定目標(biāo)序列，而不是在DNA任意位置隨意更改，使基因編輯成為可控的工具，并且規(guī)避不受控的基因突變帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。不受控制的基因突變或不夠精準(zhǔn)的基因修改，常常會(huì)帶來(lái)無(wú)法預(yù)測(cè)的腫瘤、免疫疾病等惡性病癥。在精確定位的基礎(chǔ)上，一個(gè)好的基因編輯工具還應(yīng)該能夠識(shí)別并定位到任意的設(shè)定序列。這樣基因編輯才能夠廣泛應(yīng)用于不同的基因疾病。許多基因疾病是由DNA的錯(cuò)誤表達(dá)或過(guò)度表達(dá)引起的。通過(guò)基因敲除或抑制，便能達(dá)到較好的治療效果。因此，僅僅依靠基因編輯工具進(jìn)行定位，同時(shí)引入可控的酶在這一位點(diǎn)進(jìn)行切割，便能大大緩解乃至治愈這類疾病。目前，大部分體內(nèi)基因編輯療法便是利用這一機(jī)理，對(duì)致病基因進(jìn)行定向敲除，達(dá)到治療目的。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)開(kāi)始了基因敲入的研發(fā)。相較于基因敲除，基因敲入更為復(fù)雜，往往需要基因編輯工具以及基因插入技術(shù)（例如病毒載體插入技術(shù)）共同完成，因此目前的進(jìn)展落后于基因敲除療法。但基因敲入帶來(lái)了更多治愈疾病的可能性，尤其對(duì)于部分由基因過(guò)少或缺失表達(dá)引起的疾病。基因編輯vs.基因治療：基因編輯具有永久有效的潛力雖然名稱相似，但基因編輯（geneediting）與基因治療（genetherapy）有著本質(zhì)的不同。基因編輯，通過(guò)對(duì)基因進(jìn)行改造，糾正錯(cuò)誤的基因。由于這一改變發(fā)生在原本的基因組中，因此，就算細(xì)胞發(fā)生了分裂，這一改變也會(huì)被繼承。因此，基因編輯通常被認(rèn)為具有永久糾正致病基因的潛力。更進(jìn)一步，若這一改變發(fā)生在性細(xì)胞中，則這一改變將可能被后代繼承?；蛑委煟瑒t是通過(guò)遞送額外的基因進(jìn)入細(xì)胞，使得細(xì)胞能夠額外表達(dá)上述基因，但并不改變此前已經(jīng)存在的基因。新的基因也不會(huì)被整合進(jìn)入原本的基因組中，因此，在細(xì)胞發(fā)生分裂后，這一改變也不會(huì)被繼承。理論上來(lái)講，相較于基因編輯，基因治療的持久性稍差?；蚓庉嫀ьI(lǐng)生物藥物進(jìn)入新階段人類對(duì)生物醫(yī)藥的探索不斷，所掌握的藥物種類不斷豐富。從小分子化學(xué)藥到生物藥、核酸干擾藥物（RNAi）、基因治療、基因編輯治療。隨著藥物種類的豐富，治療能夠觸達(dá)的靶點(diǎn)也更為廣闊：小分子化學(xué)藥和生物藥（單抗、雙抗等）作用于蛋白質(zhì)，RNAi作用于RNA，基因治療和基因編輯則作用于DNA?；蚓庉嫻ぞ撸篊RISPR推動(dòng)革新基因編輯TALENTALEN，TranscriptionActivation-LikeEffectorNucleases，是一種限制性酶。通過(guò)工程化改造后，具有切割DNA鏈特定位點(diǎn)的能力。TALEN主要分為2個(gè)功能域：DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain）和DNA切割域（DNAcleavagedomain）。DNA結(jié)合域負(fù)責(zé)識(shí)別位點(diǎn)，引導(dǎo)切割酶至正確的編輯位點(diǎn)。DNA結(jié)合域的核心部分由相連的數(shù)個(gè)重復(fù)的氨基酸序列片段組（tandemaminoacidrepeats）組成，每個(gè)氨基酸片段組由33-34個(gè)單位的氨基酸構(gòu)成，每個(gè)片段組對(duì)應(yīng)DNA鏈上的1個(gè)堿基。每個(gè)氨基酸片段組的序列基本相同，除了第12-13個(gè)氨基酸不同，這兩個(gè)位點(diǎn)被稱為repeat-variablediresidue（RVD）。正因?yàn)檫@2個(gè)位置的氨基酸可變，因此通過(guò)控制這兩個(gè)位置的氨基酸，基因編輯工具可以靶向DNA的4種不同堿基。每個(gè)片段組對(duì)應(yīng)1個(gè)DNA堿基，數(shù)個(gè)前后銜接的片段組便可以靶向特定的DNA序列。DNA切割域在DNA結(jié)合域的幫助下，來(lái)到選定的位點(diǎn)進(jìn)行切割。FokI內(nèi)切酶是常見(jiàn)的切割工具。FokI需要形成二倍體（dimer）來(lái)進(jìn)行切割，因此TALEN通常由2條分別靶向DNA正鏈和反鏈的TALEN組成。TALEN將會(huì)切割2個(gè)靶向序列之間的位置。CRISPRCRISPR，ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat，來(lái)源于細(xì)菌和其他微生物。CRISPR是細(xì)菌對(duì)抗病毒入侵的重要免疫機(jī)制，通過(guò)識(shí)別病毒基因序列，CRISPR可以引導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)的生物機(jī)制對(duì)病毒基因序列進(jìn)行摧毀和消滅，使病毒無(wú)法在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制繁殖。CRISPR是細(xì)菌基因組內(nèi)的一片由短小DNA重復(fù)片段（回文）和spacer組成的區(qū)域。當(dāng)某一種類病毒首次入侵時(shí)，病毒的部分基因片段會(huì)被整合存儲(chǔ)在spacer中。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄（transcription）和各類蛋白的處理，帶有病毒基因序列的

CRISPRRNA（crRNA）形成，并引導(dǎo)分子切割機(jī)制對(duì)病毒基因進(jìn)行切割。由于序列直接由病毒基因復(fù)制得到，因此crRNA與病毒基因的識(shí)別匹配程度非常高。CRISPR機(jī)制賦予了一個(gè)可靠的定位機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，一個(gè)完整的基因編輯工具還需要切割機(jī)制來(lái)對(duì)DNA鏈進(jìn)行切割。自然界中，細(xì)菌的CRISPR免疫系統(tǒng)中包含的Cas家族基因（CRISPR-associatedgene）便可以完成這一工作。Cas家族中包含多個(gè)不同的基因，擁有不同的功能或切割方式。gRNA負(fù)責(zé)是CRISPR基因編輯的定位器。gRNA由crRNA和tracrRNA組成。crRNA攜帶有目標(biāo)序列的RNA。crRNA和tracrRNA形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，科學(xué)家進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將crRNA和tracrRNA相連，并不影響整體機(jī)制的運(yùn)作和活性。形成的單鏈gRNA（sgRNA）更為便捷。Cas蛋白是負(fù)責(zé)切割DNA鏈的剪刀。Cas蛋白中，HNH域負(fù)責(zé)切割靶序列，RuvC域負(fù)責(zé)切割靶序列的互補(bǔ)鏈。切割位點(diǎn)與PAM序列相關(guān)。此前CRISPR無(wú)法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用，原因是CRISPR-Cas系統(tǒng)無(wú)法穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核。張鋒團(tuán)隊(duì)在Cas蛋白序列上添加了NLS（Nuclearlocalizationsequence），NLS與入核載體相互作用，將Cas運(yùn)載進(jìn)入細(xì)胞核。基因編輯治療路徑：體內(nèi)VS.體外基因編輯治療根據(jù)基因編輯發(fā)生的場(chǎng)景主要分為2條路徑：體內(nèi)（invivo）和體外（exvivo）。體內(nèi)基因編輯指將基因編輯工具遞送進(jìn)入患者體內(nèi)，基因編輯發(fā)生在人體內(nèi)。而顧名思義，體外基因編輯治療中，基因編輯發(fā)生在體外（例如實(shí)驗(yàn)室等），通常需要提取患者細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)患者細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，再將經(jīng)工程化改造后的細(xì)胞回輸至患者體內(nèi)。整體流程類似于現(xiàn)有的CART細(xì)胞治療。兩條路徑各有優(yōu)勢(shì)，也各有不同的技術(shù)挑戰(zhàn)。目前來(lái)看，采用體外基因編輯路徑的公司相對(duì)更多。這一選擇可能是由于體內(nèi)基因編輯對(duì)安全性的要求更高、技術(shù)難度更大。體內(nèi)基因編輯–基因敲除結(jié)構(gòu)與機(jī)理體內(nèi)基因編輯是指將基因編輯工具遞送進(jìn)入人體，在人體中對(duì)致病基因進(jìn)行編輯處理的治療方式。從編輯方式來(lái)看，可分為敲除（knock-out）和敲入（knock-in）兩種模式，也可同時(shí)進(jìn)行敲除和敲入。敲除，顧名思義，即是將某些錯(cuò)誤表達(dá)或過(guò)度表達(dá)的基因進(jìn)行抑制，使得患者身體不再繼續(xù)生產(chǎn)錯(cuò)誤的蛋白。相反，敲入則是將患者缺失的基因遞送進(jìn)入體內(nèi)，使患者能夠正常生產(chǎn)之前缺失的蛋白。相較于敲除，敲入的技術(shù)難度較高，目前進(jìn)度也相對(duì)滯后。從技術(shù)角度來(lái)說(shuō)，敲入包含了敲除所需的所有技術(shù)步驟，同時(shí)還需要額外的插入技術(shù)。因此，本章節(jié)中將主要介紹敲除，在下一章節(jié)簡(jiǎn)單介紹敲入。目前這一路徑的領(lǐng)導(dǎo)者是諾貝爾獎(jiǎng)得主、UCBerkeley

教授JenniferDoudna作為共同創(chuàng)始人的IntelliaTherapeutics。以Intellia的管線之一NTLA-2002為例，以此窺探體內(nèi)基因編輯療法的大概原理。NTLA-2002的有效成分由脂質(zhì)微粒（lipidnanoparticle，LNP）包裹，以內(nèi)含體（endosome）的形式進(jìn)入細(xì)胞。藥物有效成分主要由2種分子組成：靶向目標(biāo)基因序列（此處NTLA-2002中，即KLKB1基因）的guideRNA（gRNA），以及編碼Cas9的mRNA。Cas9mRNA在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后被核糖體翻譯為Cas9蛋白。Cas9蛋白與gRNA形成結(jié)合體，并進(jìn)入細(xì)胞核。gRNA將結(jié)合體引導(dǎo)至設(shè)定的基因序列，Cas9對(duì)其進(jìn)行切割。由此，致病基因不再能夠產(chǎn)生致病蛋白。永久糾正致病基因由于體內(nèi)基因編輯直接作用于人體DNA，因此其對(duì)基因的糾偏將被存儲(chǔ)于人體的遺傳信息中。細(xì)胞分裂后的子細(xì)胞將會(huì)繼承編輯后的DNA。因此，通過(guò)一次高效的基因編輯，致病基因有望永久被糾正。這一特征已在Intellia的兩個(gè)產(chǎn)品管線中體現(xiàn)。NTLA-2001，用于治療由轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（ATTR）造成的神經(jīng)疾病和心肌疾病，只需1次給藥，便可使蛋白淀粉樣沉淀長(zhǎng)時(shí)間維持較低水平。Intellia表示其有潛力在患者一生的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定抑制TTR（“l(fā)ifelong,stableTTRreduction”）。另一管線，NTLA-2002，用于治療遺傳性血管水腫（HAE），同樣也只需1次給藥，從目前的臨床研究患者跟蹤來(lái)看，藥效明顯且持續(xù)。由于1次給藥即可發(fā)揮持久的藥效，基因編輯療法無(wú)需冗長(zhǎng)繁瑣的療程，有望明顯提高患者的依從性。精確靶向致病源頭由于CRISPR對(duì)基因序列的識(shí)別具有較高的精度，因此體內(nèi)基因編輯治療能夠精確靶向致病基因，而不影響人體其他機(jī)制的正常工作。LNP遞送已得到驗(yàn)證體內(nèi)基因編輯療法的主要作用成份是2種RNA，因此需要進(jìn)入細(xì)胞后才可發(fā)揮作用。目前針對(duì)RNA疫苗及藥物，最主要的遞送系統(tǒng)之一便是脂質(zhì)納米微粒（LNP）。LNP遞送系統(tǒng)在本次新冠mRNA疫苗中已獲得了較為充分的驗(yàn)證。LNP由4種主要成分構(gòu)成：可陽(yáng)離子化脂質(zhì)（cationicionizablelipid）、中性脂質(zhì)、膽固醇、PEG。其中，可陽(yáng)離子化脂質(zhì)是核心成分，它深刻影響著RNA遞送進(jìn)入細(xì)胞后的釋放。在進(jìn)入細(xì)胞前，可陽(yáng)離子化脂質(zhì)在常規(guī)的生理環(huán)境下呈中性。包裹RNA藥物成分的LNP抵達(dá)細(xì)胞后，以內(nèi)含體（endosome）的形式進(jìn)入細(xì)胞。由于內(nèi)含體內(nèi)部環(huán)境逐漸酸性化（endosomalacidification），可陽(yáng)離子化脂質(zhì)質(zhì)子化（protonate），與中性脂質(zhì)互相作用，破壞原本LNP以及內(nèi)含體的結(jié)構(gòu)，使得RNA能夠逃離，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。因此，一個(gè)優(yōu)秀的可陽(yáng)離子化脂質(zhì)以及LNP結(jié)構(gòu)能夠在藥物進(jìn)入細(xì)胞前穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)，保護(hù)運(yùn)載的RNA；在進(jìn)入細(xì)胞后，又能夠充分打開(kāi)包裹，使得RNA能夠充分地釋放到細(xì)胞質(zhì)中，以實(shí)現(xiàn)較好的藥效。LNP能夠遞送較大分子量的藥物成分進(jìn)入細(xì)胞。因此，能夠較好地包裹gRNA和Cas9mRNA。LNP具有生物降解性。因其主要構(gòu)成成分為脂質(zhì)，可通過(guò)人體正常的代謝活動(dòng)降解，對(duì)人體造成的負(fù)擔(dān)有限。LNP安全性較好。相對(duì)于其他遞送系統(tǒng)，例如病毒載體，其本身的免疫原性較低，因此不易引起免疫系統(tǒng)過(guò)度反應(yīng)。LNP規(guī)?；a(chǎn)相對(duì)簡(jiǎn)單，放大生產(chǎn)難度低，同時(shí)已有mRNA疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)經(jīng)驗(yàn)。LNP可通過(guò)外層結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，來(lái)靶向特定的器官或細(xì)胞種類。除技術(shù)方面外，使用LNP目前面臨的一大挑戰(zhàn)是專利問(wèn)題。目前最常見(jiàn)的規(guī)避專利的方法是自主設(shè)計(jì)可陽(yáng)離子化脂質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。這對(duì)研發(fā)團(tuán)隊(duì)在生物化學(xué)及分子生物學(xué)的素養(yǎng)提出了較高的要求。安全風(fēng)險(xiǎn)仍是重中之重，風(fēng)險(xiǎn)獲益比是適應(yīng)癥選擇的關(guān)鍵由于CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的底層運(yùn)作必須經(jīng)過(guò)雙鏈斷裂（DSB，double-strandbreaking），而DSB對(duì)于基因而言是一個(gè)較大的變動(dòng)，其本身可控性較差，難以預(yù)測(cè)可能造成的結(jié)果，帶來(lái)了腫瘤、免疫疾病的風(fēng)險(xiǎn)。相較于體外基因編輯可以通過(guò)質(zhì)量控制來(lái)掌控進(jìn)入人體的編輯產(chǎn)物，體內(nèi)基因編輯無(wú)法進(jìn)行類似的質(zhì)量控制，因?yàn)轶w內(nèi)基因編輯是將編輯工具送入人體內(nèi)，在人體中完成編輯工作，因此，若出現(xiàn)脫靶事件，錯(cuò)誤編輯的細(xì)胞仍會(huì)留在體內(nèi)。因此，相較于體外基因編輯，體內(nèi)基因編輯的安全風(fēng)險(xiǎn)更大，這也將是這類療法面臨監(jiān)管審批時(shí)最大的挑戰(zhàn)。因此，適應(yīng)癥的選擇非常重要。在安全性未確定的情況下，未被滿足的醫(yī)療需求，尤其是目前尚未有有效療法，生存期較短和生存概率低的病癥，可能是體內(nèi)基因編輯治療較好的選擇。體內(nèi)基因編輯–基因敲入設(shè)計(jì)和技術(shù)原理如上文所述，體內(nèi)基因編輯相較于體外基因編輯難度更高，而體內(nèi)基因編輯中，基因敲入比基因敲除難度更高。因此，基因敲入所需掌握的技術(shù)復(fù)雜，要求高。因此目前進(jìn)展也落后于其他路徑。從步驟上來(lái)看，基因敲除通過(guò)CRISPR系統(tǒng)gRNA和Cas在特定位點(diǎn)剪切DNA鏈，造成雙鏈斷裂（DSB），使靶點(diǎn)基因無(wú)法正常表達(dá)。根據(jù)Intellia的設(shè)計(jì)思路，基因敲入同樣需要CRISPR系統(tǒng)先剪切DNA雙鏈，再通過(guò)病毒載體（Intellia目前使用的是腺相關(guān)病毒AAV作為載體）在剪切位置插入缺失的基因。因此基因敲入由2個(gè)部分組成。第一部分由LNP作為遞送系統(tǒng)包裹用于定位的gRNA和編碼Cas（用于切割）的mRNA，在設(shè)定位點(diǎn)進(jìn)行切割。第二部分由病毒載體作為遞送系統(tǒng)，將患者缺失的基因遞送進(jìn)入細(xì)胞核，并整合進(jìn)患者基因中。AAV可將希望遞送的基因片段包裹進(jìn)病毒載體顆粒。病毒載體經(jīng)細(xì)胞表面的受體識(shí)別，由內(nèi)含體（endosome）包裹進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞后，部分病毒顆粒從內(nèi)含體逃逸至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，部分病毒顆粒則跟隨內(nèi)含體到達(dá)溶酶體（lysosome）后再逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。隨后，病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞核，并褪去外殼，將攜帶的基因釋放出來(lái)。在上一步中，gRNA和Cas蛋白已在DNA上的特定位點(diǎn)進(jìn)行了剪切。細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制會(huì)試圖將斷裂的DNA重新連接在一起。常見(jiàn)的修復(fù)機(jī)制有兩種，HDR（homology-directedrepair，同源介導(dǎo)修復(fù)）和NHEJ（non-homologousend-joining，非同源末端接合）。實(shí)現(xiàn)基因敲入需要HDR修復(fù)，而NHEJ無(wú)法幫助實(shí)現(xiàn)基因敲入。HDR：是最為重要且常見(jiàn)的修復(fù)方式，同時(shí)也是實(shí)現(xiàn)基因敲入所需要的修復(fù)方式。HDR通過(guò)模版序列來(lái)修復(fù)斷裂的部分。模版序列可來(lái)自另一條姊妹染色體也可來(lái)自外部引入的DNA模版。模版序列的特征是擁有和斷裂DNA兩端相同的序列。HDR修復(fù)機(jī)制會(huì)根據(jù)模版序列將斷裂部分填補(bǔ)上，因此，若以姊妹染色體作為模版序列，斷裂的DNA將被恢復(fù)成原樣；若以外部引入的序列作為模版，修復(fù)后的DNA將包含模版中間的序列。因此，設(shè)計(jì)的序列將在兩端包含DNA斷裂兩側(cè)的序列，中間則是希望敲入的基因序列。在通過(guò)AAV將序列遞送進(jìn)入細(xì)胞核后，便可作為模版序列供HDR對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)后的DNA便包含了希望敲入的基因。NHEJ：作為最主要的DNA雙鏈斷裂的修復(fù)方式，本身具有較大的不確定性，在修復(fù)后常常會(huì)引入不同種類的突變（插入、刪除、替換），因此可能會(huì)產(chǎn)生框架漂移，導(dǎo)致錯(cuò)誤的基因表達(dá)。由于基因突變通常會(huì)抑制基因的正常表達(dá)，因此NHEJ一般能夠在基因敲除中發(fā)揮作用。但在基因敲入方面，則不希望出現(xiàn)NHEJ，因?yàn)镹HEJ重新連接斷裂DNA的序列是不確定的。HDR修復(fù)機(jī)制是合適的修復(fù)種類，因?yàn)镠DR可能采用利用AAV病毒載體遞送進(jìn)來(lái)的基因物質(zhì)作為模板，對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。NHEJ是不合適的修復(fù)機(jī)制。因?yàn)镹HEJ修復(fù)僅僅將斷裂的DNA連接起來(lái)，但如何連接是隨機(jī)的。NHEJ不僅不會(huì)按照AAV遞送的模板基因序列進(jìn)行修復(fù)，還有可能引入其他突變。因此，如何使細(xì)胞盡可能多地采用HDR修復(fù)，是目前研究的關(guān)鍵點(diǎn)之一。DNA修復(fù)機(jī)制不確定性較高DNA雙鏈斷裂（DSB）的修復(fù)具有較高的不確定性。不確定性主要來(lái)自2方面：修復(fù)方式的選擇和修復(fù)方式本身的隨機(jī)性。首先，如上文所述，DNA雙鏈斷裂的修復(fù)機(jī)制主要是HDR和NHEJ。其中，只有HDR有可能實(shí)現(xiàn)基因敲入；NHEJ無(wú)法實(shí)現(xiàn)敲入，相反，NHEJ常常引入更多不確定的突變，例如：插入、刪減、替換，有可能造成框架漂移，引起腫瘤或其他疾病。因此，在CRISPR系統(tǒng)引入雙鏈斷裂后，希望人體盡可能多地使用HDR作為修復(fù)方式，并盡量減少NHEJ的發(fā)生。但是，細(xì)胞會(huì)選擇哪一種修復(fù)方式是不確定的，并且，修復(fù)方式的選擇受多種因素影響。在一項(xiàng)發(fā)表在Nature的研究中，來(lái)自Bio-Rad和UCSF的團(tuán)隊(duì)試圖量化HDR和NHEJ發(fā)生的比例，并找到增加HDR、減少NHEJ的變量。研究發(fā)現(xiàn)，影響HDR和NHEJ發(fā)生比例的因素多種多樣，例如基因編輯工具的種類、Cas蛋白的選擇、gRNA的組合、方向、細(xì)胞種類、編輯位點(diǎn)等，都會(huì)對(duì)HDR和NHEJ的占比產(chǎn)生影響。因此，針對(duì)不同適應(yīng)癥、不同基因位點(diǎn)、不同細(xì)胞種類，基因敲入治療所需的gRNA、Cas蛋白、AAV序列等成分均需要新設(shè)計(jì)，同時(shí)進(jìn)行排列組合，找出最佳搭配。在初始階段，這一過(guò)程需要大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，研發(fā)時(shí)間長(zhǎng)，因此，如果能夠成功，行業(yè)領(lǐng)軍者將獲得明顯的先發(fā)優(yōu)勢(shì)護(hù)城河。當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的積累足夠充分后，后續(xù)的研發(fā)有望逐漸提速，因此，先發(fā)者的先發(fā)優(yōu)勢(shì)將有可能逐漸擴(kuò)大。不確定性還來(lái)自于HDR機(jī)制本身。雖然相較于NHEJ，HDR被認(rèn)為是較為精準(zhǔn)、不易出錯(cuò)的修復(fù)方式，但仍有可能因?yàn)榛蛑亟M反應(yīng)（recombination）產(chǎn)生突變。綜合以上兩點(diǎn)，對(duì)于基因敲入至關(guān)重要的修復(fù)機(jī)制卻有不可忽視的不確定性，這對(duì)于最終基因編輯能否正確成功完成提出了挑戰(zhàn)。AAV設(shè)計(jì)復(fù)雜，運(yùn)載能力有限。AAV，Adeno-associatedvirus，腺相關(guān)病毒，是一種單鏈DNA病毒。自然界中，AAV在許多脊椎動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，但目前普遍認(rèn)為AAV并不會(huì)引起人類疾病。AAV衣殼呈二十面體，直徑約26nm，AAV的基因組由正向或反向的單鏈DNA構(gòu)成，長(zhǎng)度約4.7kb，這也基本決定了AAV被改造為遞送載體后它的載荷大致在這一水平。AAV基因組兩側(cè)分別有1個(gè)ITR（invertedterminalrepeat）作為側(cè)翼，ITR呈T形，在病毒復(fù)制與包封過(guò)程中起重要作用。AAV作為載體時(shí)，將編碼病毒蛋白的基因組去除，并用遞送的基因序列代替。AAV的載荷在4.7kb左右，這其中除希望表達(dá)的基因外，部分情況下還包含調(diào)節(jié)表達(dá)的序列，例如啟動(dòng)子（promoter）。因此，AAV能夠遞送的基因材料相對(duì)有限。人體免疫屏障可能降低AAV遞送效率AAV遞送可能會(huì)受到多種、多層人體免疫系統(tǒng)的抵抗，導(dǎo)致遞送效率降低。中和抗體：感染自然腺相關(guān)病毒后產(chǎn)生的中和抗體在人體中循環(huán)。中和抗體能夠識(shí)別AAV類病毒的衣殼，因此不僅靶向自然AAV，也靶向重組AAV。目前，有研究團(tuán)隊(duì)正在探索衣殼改造的方法，以規(guī)避免疫系統(tǒng)的檢驗(yàn)，但目前還處于早期階段。除此之外，也有空衣殼誘餌、血漿去除等其他策略正在研究中。另外，病毒衣殼還有可能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CytotoxicTlymphocyte，CTL）免疫，AAV成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將可能受到攻擊，導(dǎo)致成功進(jìn)行了基因編輯的細(xì)胞被殺死。雖然相較于其他病毒載體（例如腺病毒載體），AAV誘導(dǎo)的CTL強(qiáng)度較低，但仍然影響整體遞送效率和基因編輯治療的有效性。體內(nèi)基因編輯特點(diǎn)1：體內(nèi)基因編輯有望實(shí)現(xiàn)“一次給藥，永久治愈”。特點(diǎn)2：相較于體外，體內(nèi)基因編輯對(duì)技術(shù)的精準(zhǔn)性和可靠性要求更高，因?yàn)榛蚓庉嫲l(fā)生在人體內(nèi)，所以無(wú)法通過(guò)質(zhì)量控制環(huán)節(jié)篩除編輯失敗的細(xì)胞。特點(diǎn)3：體內(nèi)基因編輯主要可分為基因敲除和基因敲入。其中基因敲入環(huán)節(jié)更多，需要掌握的技術(shù)也更多，目前基因敲入進(jìn)展也較慢，尚未有產(chǎn)品進(jìn)入臨床階段。特點(diǎn)4：基因敲除通常使用LNP遞送系統(tǒng)運(yùn)輸CRISPR編輯工具進(jìn)入體內(nèi)，基因敲入不僅需要LNP遞送編輯工具，還需要遞送修復(fù)模版（通常使用病毒載體AAV作為遞送系統(tǒng)）。特點(diǎn)5：這一細(xì)分市場(chǎng)，參與者較少。目前IntelliaTherapeutics擁有較明顯的領(lǐng)跑優(yōu)勢(shì)。體外基因編輯體外基因編輯助力細(xì)胞治療相較于體內(nèi)編輯，體外基因編輯是競(jìng)爭(zhēng)者較多的細(xì)分賽道。主要原因是體外基因編輯可以通過(guò)質(zhì)量控制保證基因編輯的質(zhì)量，將不達(dá)標(biāo)的細(xì)胞去除，從安全性的角度來(lái)看更為可靠，也更容易被監(jiān)管機(jī)構(gòu)所接受。從某個(gè)角度來(lái)說(shuō)，體外基因編輯是利用基因編輯工具賦能細(xì)胞治療。目前的細(xì)胞治療，受制于細(xì)胞免疫機(jī)制，以自體型為主。但自體型細(xì)胞治療的缺陷也較為明顯：首先，由于所有細(xì)胞均來(lái)自于患者自身，因此成本較高，也無(wú)法規(guī)模生產(chǎn)，導(dǎo)致價(jià)格一直居高不下。第二，由于每個(gè)患者接受的細(xì)胞治療都是個(gè)體化產(chǎn)品，因此制備所需時(shí)間較長(zhǎng)。同時(shí)，治療過(guò)程較為繁瑣，對(duì)患者的生理和心理的消耗較大。由于自體型細(xì)胞治療有著上述的種種缺陷，通用型（Allogeneic）細(xì)胞治療吸引了大量關(guān)注。相較于自體型細(xì)胞治療，通用型細(xì)胞治療的優(yōu)勢(shì)在于：可以提前制備，不需患者等待。環(huán)節(jié)減少，不需要從患者體內(nèi)提取細(xì)胞，減少患者負(fù)擔(dān)。產(chǎn)品一致性更佳，因此有望實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，成本可能降低。但挑戰(zhàn)也隨之而來(lái)，自體型細(xì)胞治療最大的障礙便是降低免疫排異反應(yīng)。多種人體免疫機(jī)制限制細(xì)胞治療排異反應(yīng)來(lái)自多個(gè)人體免疫機(jī)制，例如T細(xì)胞和NK細(xì)胞（與HLA基因相關(guān)）。同時(shí)，若輸注的治療細(xì)胞量較大的話，輸注細(xì)胞可能會(huì)對(duì)人體細(xì)胞產(chǎn)生排異（與TCR相關(guān)）（GvHD）。基因編輯改造細(xì)胞，盡量避免不需要的免疫機(jī)制通過(guò)基因編輯，盡量干擾或阻斷引起排異反應(yīng)的信號(hào)通路。Intellia在此提供了一些可能的改進(jìn)思路。例如：通過(guò)敲除治療細(xì)胞的TCR來(lái)避免移植物排斥宿主病（GvHD）；通過(guò)基因敲入引入CAR或TCR來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷；敲除II型HLA基因來(lái)避免CD-4介導(dǎo)的排異反應(yīng)；敲除HLA-A來(lái)避免CD-8介導(dǎo)的排異反應(yīng)；調(diào)整HLA-B和HLA-C來(lái)避免NK細(xì)胞介導(dǎo)的排異反應(yīng)CRISPRTherapeutics第一代體外基因編輯產(chǎn)品設(shè)計(jì)也遵循類似的設(shè)計(jì)理念：通過(guò)敲除β2M來(lái)去除MHC1的表達(dá)，使CAR-T細(xì)胞不容易被患者的免疫系統(tǒng)識(shí)別；通過(guò)干擾TCR的表達(dá)，使CAR-T細(xì)胞不再排斥患者體內(nèi)的細(xì)胞；利用CRISPR技術(shù)，將CAR序列精準(zhǔn)插入至TRAC位點(diǎn)，提高一致性和安全性?；蚓庉嫺脑旒?xì)胞，加強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力通過(guò)基因編輯，除了可以干擾或阻斷引起排異反應(yīng)的信號(hào)通路，也可以增強(qiáng)治療細(xì)胞的有效性。CRISPRTherapeutics第二代體外基因編輯產(chǎn)品是針對(duì)腫瘤的一款細(xì)胞治療，產(chǎn)品設(shè)計(jì)在第一代基礎(chǔ)上繼續(xù)改進(jìn)：通過(guò)干擾Regase-1的表達(dá)，使細(xì)胞素分泌增加，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性；敲除TGFBR2，使CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞分泌的TGF-β不再敏感，加強(qiáng)殺傷。CRISPRTherapeutics第一代體外基因編輯產(chǎn)品的設(shè)計(jì)主要利用基因編輯技術(shù)增強(qiáng)了產(chǎn)品的安全性，避免不必要的免疫排斥。第二代體外基因編輯產(chǎn)品設(shè)計(jì)在第一代基礎(chǔ)上的改進(jìn)主要是為了增強(qiáng)工程細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。對(duì)不同基因的編輯，給細(xì)胞治療帶來(lái)了更大的設(shè)計(jì)空間，更多的改進(jìn)方向。尋找合適的策略和編輯位點(diǎn)，考驗(yàn)研發(fā)機(jī)構(gòu)對(duì)細(xì)胞機(jī)制的理解水平基因編輯提供了有力的改進(jìn)細(xì)胞治療的方法和工具箱。如何利用好基因編輯，使基因編輯發(fā)揮最大的效益，考驗(yàn)研發(fā)團(tuán)隊(duì)對(duì)細(xì)胞機(jī)制的理解水平。CRISPRTherapeutics提供了一個(gè)范例。CRISPRTherapeutics的研發(fā)人員們發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞不需過(guò)長(zhǎng)的體內(nèi)留存時(shí)間。CAR-T細(xì)胞在人體內(nèi)的PK特征呈現(xiàn)較明顯的3個(gè)階段。第一階段CAR-T細(xì)胞尋找腫瘤所在的靶點(diǎn)；第二階段CAR-T細(xì)胞開(kāi)始擴(kuò)增，攻擊腫瘤細(xì)胞；第三階段，CAR-T細(xì)胞被自身免疫系統(tǒng)清除。研究發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后便內(nèi)快速響應(yīng)，一般不需留存28天便能實(shí)現(xiàn)持續(xù)的病情緩解。此外，NK細(xì)胞未在腫瘤處聚集，意味著繼續(xù)降低CAR-T免疫原性的收益不高。因此，研發(fā)團(tuán)隊(duì)轉(zhuǎn)向?qū)ふ姨岣哂行缘姆桨?。體外基因編輯特點(diǎn)特點(diǎn)1：相較于體內(nèi)，體外基因編輯安全性、可控性更佳。特點(diǎn)2：許多體外基因編輯管線可以看作是細(xì)胞治療的升級(jí)，是使用基因編輯技術(shù)賦能細(xì)胞治療，改善治療細(xì)胞的免疫原性、提高安全性、增強(qiáng)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力（若適應(yīng)癥為癌癥）。特點(diǎn)3：針對(duì)不同適應(yīng)癥，可進(jìn)行不同的設(shè)計(jì)，使治療細(xì)胞的不同能力得到加強(qiáng)。特點(diǎn)4：基因編輯提供了大量細(xì)胞治療升級(jí)的可能性，但哪些方向、策略最有價(jià)值，非?？简?yàn)研發(fā)團(tuán)隊(duì)對(duì)細(xì)胞機(jī)制的理解和積累。AI在其中可能能夠提升篩選效率。特點(diǎn)5：CRISPRTherapeutics與Vertex合作開(kāi)發(fā)的Exa-cel有望成為首個(gè)獲批的基因編輯療法。該產(chǎn)品用于治療TDT和SCD的上市申請(qǐng)已于2023年1月獲EMA受理，于2023年4月3日完成了向FDA提起的BLA。Exa-cel已獲得FDA授予的RMAT、快速通道、孤兒藥認(rèn)證，和EMA授予的優(yōu)先藥物（PRIME）認(rèn)證。全球研發(fā)進(jìn)展案例1：NTLA-2001——體內(nèi)基因編輯-基因敲除NTLA-2001是IntelliaTherapeutics目前進(jìn)展最快的管線之一。NTLA-2001用于治療由轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（TransthyretinAmyloidosis，ATTR）引起的疾病。目前已開(kāi)展了2項(xiàng)臨床I期研究，分別針對(duì)由ATTR引起的多發(fā)性神經(jīng)疾病和心肌疾病。ATTR病癥及患者規(guī)模：疾病負(fù)擔(dān)沉重及醫(yī)療需求未被滿足的罕見(jiàn)病ATTR蛋白淀粉樣變性是由于錯(cuò)誤折疊的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白不斷積累產(chǎn)生的。ATTR主要影響神經(jīng)及心臟功能。根據(jù)Intellia官網(wǎng)2023Q1CorporateOverview信息，全球范圍內(nèi)，受遺傳性ATTR困擾的患者規(guī)模約50000人，野生型ATTR患者20-50萬(wàn)人。ATTR伴隨心肌疾病患者診斷后的預(yù)期生存周期約2-7年，ATTR伴隨多發(fā)性神經(jīng)疾病患者的預(yù)期生存期約10年。ATTR可能引起多種不良反應(yīng)，例如心衰、呼吸困難、虛弱、知覺(jué)喪失等，且治療通常需要延續(xù)一生，疾病負(fù)擔(dān)較重。研究證明TTR基因表達(dá)的抑制，可以改善ATTR引起的多發(fā)性神經(jīng)疾病的癥狀。此前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的首個(gè)siRNA藥物Patisiran（商品名Onpattro，由Alnylam公司研發(fā)）通過(guò)小核酸干擾機(jī)制抑制TTR蛋白的表達(dá)，改善了患者癥狀。在Patisiran的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)改良神經(jīng)病變損傷評(píng)分mNIS+7與轉(zhuǎn)甲狀腺素水平有著密切聯(lián)系。目前全球?qū)τ贏TTR的治療手段非常匱乏。在2017年FDA批準(zhǔn)siRNA藥物Patisiran上市前，幾乎沒(méi)有有效藥物，只能通過(guò)肝臟移植以及僅在部分國(guó)家獲批的氯苯唑酸進(jìn)行治療。ATTR是一種典型的醫(yī)療需求未被滿足的罕見(jiàn)病。近年來(lái)，F(xiàn)DA陸續(xù)批準(zhǔn)了Onpattro、Amvuttra、Tegsedi、Vyndamax、Vyndaqel用于ATTR引起的不同病癥。但上述藥物價(jià)格都較為昂貴。臨床設(shè)計(jì)Intellia的NTLA-2001已進(jìn)入臨床I期研究，這是一項(xiàng)針對(duì)2項(xiàng)適應(yīng)癥進(jìn)行的開(kāi)放標(biāo)簽、多中心研究。研究分別對(duì)藥物在遺傳性ATTR引起的多發(fā)性神經(jīng)疾?。ˋTTRv-PN）和ATTR引起的心肌疾?。ˋTTR-CM）的治療展開(kāi)了探索。兩個(gè)適應(yīng)癥的給藥方式均采取1劑次靜脈注射（IV）。兩個(gè)適應(yīng)癥的研究均分為兩個(gè)部分，第一部分為單劑次劑量爬坡，第二部分為劑次擴(kuò)張（以第一部分研究后選定的劑量為基礎(chǔ)）。主要臨床終點(diǎn)為安全性、耐受性、PK及PD，對(duì)血清TTR水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。次要臨床終點(diǎn)分別對(duì)神經(jīng)功能和心臟類疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)評(píng)判。針對(duì)ATTRv-PN多發(fā)性神經(jīng)疾病，單劑量爬坡研究設(shè)置的劑量組分別為1.0mg/kg、0.7mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg。次要臨床終點(diǎn)中的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為NIS（神經(jīng)損傷評(píng)分，neuropathyimpairmentscore）和mNIS+7（改良神經(jīng)損傷評(píng)分+7，modifiedNIS+7）。針對(duì)ATTR-CM心肌疾病，單劑量爬坡研究中，研究者根據(jù)NYHA分類將患者分為3個(gè)組別：針對(duì)I型/II型患者給藥0.7mg/kg、針對(duì)III型患者給藥0.7mg/kg、針對(duì)I型/II型患者給藥1.0mg/kg。次要臨床終點(diǎn)的評(píng)判中包含了心電圖、生物標(biāo)記物、心肺測(cè)試、6分鐘行走測(cè)試。安全性：不良反應(yīng)概率較高，但大部分不良反應(yīng)較輕NTLA-2001在兩項(xiàng)適應(yīng)癥的研究中均出現(xiàn)了較高的不良反應(yīng)概率。在針對(duì)多發(fā)性神經(jīng)疾?。ˋTTRv-PN）的研究中，所有15個(gè)受試者均出現(xiàn)了不良反應(yīng)，其中1級(jí)不良反應(yīng)73.33%（11/15），2級(jí)不良反應(yīng)13.33%（2/15），3級(jí)不良反應(yīng)13.33%（2/15）。按劑量組來(lái)看，2級(jí)和3級(jí)不良反應(yīng)案例均出現(xiàn)在0.7mg/kg和1.0mg/kg兩個(gè)高劑量組，兩個(gè)低劑量組（0.1mg/kg、0.3mg/kg）出現(xiàn)的不良反應(yīng)均為1級(jí)。在針對(duì)心肌疾?。ˋTTR-CM）的研究中，在共12人的受試者中9人（75%）出現(xiàn)了不同程度的不良反應(yīng)，其中，共2級(jí)不良反應(yīng)出現(xiàn)概率16.67%（2/12）和3級(jí)不良反應(yīng)8.33%（1/12）。不良反應(yīng)的出現(xiàn)概率、程度、以及具體原因仍舊需要繼續(xù)觀察。有效性：TTR抑制明顯且持久NTLA-2001在有效性方面顯示出令人興奮的競(jìng)爭(zhēng)力?；颊咴诮邮躈TLA-2001治療后，體內(nèi)TTR水平受到明顯抑制，并且目前已有數(shù)據(jù)顯示藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。在對(duì)多發(fā)性神經(jīng)疾病（ATTRv-PN）的研究中，除最小劑量組0.1mg/kg外，其他劑量組（0.3、0.7、1.0mg/kg）均在給藥后1個(gè)月內(nèi)實(shí)現(xiàn)TTR降低80%以上，并且抑制作用持久。截至2022年6月24日，0.3mg/kg劑量組（n=3）跟蹤時(shí)間已到達(dá)給藥后12個(gè)月，期間TTR平均抑制效果保持在80%以上，第12個(gè)月時(shí)平均抑制效果約89%。0.7mg/kg劑量組（n=3）跟蹤時(shí)間到達(dá)給藥后6個(gè)月，期間TTR平均抑制效果保持在80%以上，第6個(gè)月時(shí)平均抑制效果約87%。1.0mg/kg劑量組（n=6）中有3位受試者跟蹤時(shí)間到達(dá)9個(gè)月，其余3人到達(dá)6個(gè)月；期間TTR平均抑制效果90%以上，第6個(gè)月、第9個(gè)月時(shí)平均抑制效果均在93%左右。所有劑量組在給藥后1個(gè)月內(nèi)，TTR抑制水平便已接近峰值，并且一直穩(wěn)定在峰值附近。在針對(duì)心肌疾病（ATTR-CM）的研究中，NTLA-2001也顯示出良好的有效性。在所有三個(gè)干預(yù)組中，所有受試者的血清TTR水平在給藥后的第28天均下降了90%以上，并且維持在這一穩(wěn)定水平。截至2022年11月5日，NYHAI/II型患者接受0.7mg/kg的受試組到達(dá)給藥后6個(gè)月時(shí)間點(diǎn)，第6個(gè)月TTR平均抑制效果約93%，另外兩個(gè)組別到達(dá)給藥后4個(gè)月時(shí)間點(diǎn)，TTR平均抑制效果92%、94%。案例2：NTLA-2002——體內(nèi)基因編輯-基因敲除NTLA-2002是IntelliaTherapeutics另一條已進(jìn)入臨床研究階段的管線。NTLA-2002用于治療遺傳性血管水腫（HereditaryAngioedema，HAE）。目前已開(kāi)展了2項(xiàng)臨床I期研究，分別針對(duì)由ATTR引起的多發(fā)性神經(jīng)疾病和心肌疾病。HAE病癥及患者規(guī)模：隨機(jī)發(fā)病且可能導(dǎo)致致命后果的醫(yī)療需求未被滿足的罕見(jiàn)病HAE臨床表現(xiàn)為反復(fù)的、嚴(yán)重的、身體隨機(jī)部位的腫大。HAE對(duì)某些部位或器官的攻擊是非常危險(xiǎn)的，例如咽喉部位的腫大可能導(dǎo)致窒息。HAE發(fā)病時(shí)間、部位隨機(jī)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致住院或死亡。未經(jīng)治療的患者，平均7-14天便會(huì)受到HAE攻擊發(fā)病。HAE伴隨一生，目前的治療方法也需持續(xù)一生。全球范圍內(nèi)，平均每50000人中有1個(gè)HAE患者。美國(guó)與歐洲HAE患者超15000人。根據(jù)Intellia援引的GlobalData2022和Redbook2022數(shù)據(jù)，2026年全球市場(chǎng)空間可能達(dá)到40億美金。美國(guó)目前已有的預(yù)防性治療的年化治療費(fèi)用約50萬(wàn)美金。HAE疾病病理及NTLA-2002機(jī)制KLKB1基因?qū)allikrein（激肽釋放酶血管舒緩素）的水平起著重要作用，而Kallikrein對(duì)HMWKininogen（HMW激肽原）轉(zhuǎn)化Bradykinin（緩激肽）起促進(jìn)作用。緩激肽是一種血管擴(kuò)張劑，緩激肽過(guò)高可能引起水腫。NTLA-2002通過(guò)抑制KLKB1基因表達(dá)，控制緩激肽的水平，降低血管擴(kuò)張?jiān)斐傻乃[的風(fēng)險(xiǎn)。臨床設(shè)計(jì)NTLA-2002臨床I期研究是一項(xiàng)開(kāi)放標(biāo)簽的單劑量爬坡研究，分為3個(gè)劑量組：75mg（3人）、50mg（4人）、25mg（3人）。主要研究終點(diǎn)為安全性、耐受性，其他研究終點(diǎn)是PK、PD、有效性（發(fā)病數(shù)）。臨床II期研究是一項(xiàng)對(duì)推薦劑量進(jìn)行確認(rèn)的擴(kuò)展隨機(jī)研究。分為3組：推薦劑量組1（10人）、推薦劑量組2（10人）、安慰劑組（5人）。主要研究終點(diǎn)是有效性（16周內(nèi)發(fā)病數(shù)），其他研究終點(diǎn)包括PD、PK、安全性和耐受性、QoL生活質(zhì)量。安全性：未出現(xiàn)重度不良事件研究證明了NTLA-2002的安全性和耐受性。所有劑量組中，最常出現(xiàn)的不良反應(yīng)是注射相關(guān)反應(yīng)和疲憊。所有不良反應(yīng)均為輕度（n=5）或中度（n=2）。所有不良反應(yīng)均自行緩解。未出現(xiàn)緊急嚴(yán)重不良反應(yīng)（emergentSAE）或三級(jí)及以上治療期不良反應(yīng)（TEAE）。有效性：TTR抑制明顯且持久受試者接受NTLA-2002給藥后，所有劑量組患者血清中Kallikrein水平明顯下降。所有劑量組給藥后28天內(nèi)，基本已達(dá)到最大抑制效果。25mg組抑制水平大約64%，75mg組抑制水平約92%，50mg組給藥后時(shí)間較短，尚不能確定抑制水平。更值得注意的是，NTLA-2002帶來(lái)了顯著的臨床癥狀改善。實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)的25mg組和75mg組患者在給藥后發(fā)病頻率明顯下降。25mg組中，患者在給藥后16周內(nèi)，平均發(fā)病頻率降低91%；75mg組這一數(shù)據(jù)為78%。案例3：NTLA-3001——體內(nèi)基因編輯-基因敲入NTLA-3001是IntelliaTherapeutics進(jìn)展最快的基因敲入管線，公司表示預(yù)計(jì)將在2023年下半年向FDA提交IND申請(qǐng)。Intellia目前布局了2條路徑，靶向AATD疾病。a)NTLA-3001：插入功能正常的SERPINA1基因，使A1AT蛋白持續(xù)正常表達(dá)。主要為解決AATD相關(guān)的肺疾病。b)NTLA-2003：敲除突變的SERPINA1基因，減少并防止錯(cuò)誤的A1AT蛋白累積。主要解決AATD相關(guān)的肝疾病。AATD病癥及患者規(guī)模：可能致命的疾病負(fù)擔(dān)較重的遺傳性罕見(jiàn)病AATD，Alpha-1AntitrypsinDeficiency，胰蛋白酶缺乏癥。是一種以血清中Alpha-1抗胰蛋白酶水平下降為主要特征的常染色體共顯性遺傳病。與新生兒肝炎、嬰幼兒和成人肝硬化、肺癌、肺氣腫等關(guān)系密切。發(fā)病時(shí)間、部位隨機(jī)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致住院或死亡。未經(jīng)治療的患者，平均7-14天便會(huì)受到HAE攻擊發(fā)病。HAE伴隨一生，目前的治療方法也需持續(xù)一生。美國(guó)AATD患者超60000人，全球約25萬(wàn)AATD患者。亞洲發(fā)病率較低，較為罕見(jiàn)。臨床前研究顯示，敲入基因能夠成功穩(wěn)定表達(dá)在非人類靈長(zhǎng)類（non-humanprimate，NHP）的臨床前研究顯示，基因敲入后，人A1AT（hA1AT）表達(dá)穩(wěn)定，即使在猴（Cyno）A1AT（cA1AT）基因被敲除后，cA1AT水平出現(xiàn)明顯下滑，但hA1AT表達(dá)仍舊基本穩(wěn)定在同一水平，說(shuō)明敲入的hA1AT基因正在持續(xù)表達(dá)，并且不受cA1AT敲除的影響。在嚙齒動(dòng)物的臨床前研究顯示，敲入人FIX（hFIX）基因后，效果在12個(gè)月觀察期中持續(xù)存在，證明基因編輯的效果已經(jīng)被攜帶在正常的細(xì)胞循環(huán)中（與之相反，傳統(tǒng)藥物或治療帶來(lái)的效果會(huì)隨時(shí)間遞減，并逐漸消失）。隨后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了部分肝臟切除（PHx），以探究基因編輯是否也會(huì)被攜帶進(jìn)再生細(xì)胞中。研究結(jié)果顯示，基因編輯的效果能夠被再生細(xì)胞繼承，對(duì)照組基因治療則無(wú)此能力。研究顯示，傳統(tǒng)的基因治療在肝臟部分切除后，敲入的基因表達(dá)明顯下降（第54天表達(dá)下降85%，第85天下降95%）。而基因編輯治療后，即使經(jīng)過(guò)肝臟部分切除，基因表達(dá)仍然明顯，且較為穩(wěn)定。說(shuō)明基因編輯敲入的基因已被保存于動(dòng)物模型的基因組中，有可能已實(shí)現(xiàn)了永久敲入。案例4：Exa-cel（CTX-001）——體外基因編輯Exa-cel是CRISPRTherapeutics與Vertex聯(lián)合研發(fā)的體外基因編輯療法，也是目前進(jìn)展最快的基因編輯管線，公司表示該產(chǎn)品用于治療TDT和SCD的上市申請(qǐng)已于2023年1月獲EMA受理，于2023年4月3日完成了向FDA提起的BLA。適應(yīng)癥及患者規(guī)模：為遺傳性血液疾病的治愈帶來(lái)曙光Exa-cel的適應(yīng)癥為Beta地中海貧血（β-thalassemia）、鐮狀細(xì)胞性貧血（sicklecelldisease，SCD）。地中海貧血患者在出生后癥狀可能會(huì)進(jìn)行性加重，并有可能由于嚴(yán)重貧血、心力衰竭、營(yíng)養(yǎng)不足及感染導(dǎo)致死亡。鐮狀細(xì)胞癥可能會(huì)造成血管阻塞導(dǎo)致器官功能障礙，可能表現(xiàn)為疼痛危象、肝脾進(jìn)行性腫大、組織缺氧、炎癥等。BCL11A基因位于2號(hào)染色體上。BCL11A會(huì)抑制新生兒血紅蛋白（fetalhemoglobin，HbF）的形成。新生兒血紅蛋白HbF能夠改善上述疾病的癥狀。通過(guò)體外基因編輯，研發(fā)團(tuán)隊(duì)對(duì)CD34+HSPC細(xì)胞中紅細(xì)胞（erythroid）特異的BCL11A基因的加強(qiáng)子（enhancer）進(jìn)行抑制，以此得到改造后的細(xì)胞并給患者進(jìn)行回輸。Exa-cel的治療流程與CAR-T治療類似，預(yù)計(jì)定價(jià)較高。首先需要對(duì)患者進(jìn)行預(yù)前篩查，并收集患者自身的血液干細(xì)胞。而后，這些干細(xì)胞被送至生產(chǎn)中心進(jìn)行基因編輯改造，以及安全性檢查，質(zhì)控通過(guò)后冷凍儲(chǔ)藏。同時(shí)，患者接受輸注前的準(zhǔn)備性化療，通常使用白消安（Busulfan，二甲磺酸丁酯）?；熃Y(jié)束后，患者接受治療細(xì)胞的輸注、移植。出院后持續(xù)進(jìn)行跟蹤，了解預(yù)后情況。本質(zhì)上，Exa-cel是一個(gè)升級(jí)版的細(xì)胞治療產(chǎn)品。預(yù)計(jì)Exa-cel成本較高，定價(jià)也可能較昂貴。由于Exa-cel也是個(gè)體化方案，因此估計(jì)成本較高，定價(jià)可能會(huì)參考現(xiàn)有的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品療法。臨床設(shè)計(jì)Exa-cel針對(duì)TDT和SCD分別開(kāi)展了臨床研究。2項(xiàng)研究均取得了令人興奮的數(shù)據(jù)，并顯示Exa-cel能夠給患者帶來(lái)臨床獲益。有效性研究顯示Exa-cel能夠降低TDT患者對(duì)血液輸注的需求以及SCD患者發(fā)生血管閉塞危象的概率。在針對(duì)TDT適應(yīng)癥的研究中，受試者接受exa-cel治療后，42/44患者已停止輸注紅細(xì)胞。其中持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)的已有36.2個(gè)月沒(méi)有進(jìn)行輸注。2位還未停止輸注的患者，所需輸注的紅細(xì)胞量已明顯減少，分別下降了75%、89%。在針對(duì)SCD適應(yīng)癥的研究中，接受exa-cel治療后，所有31個(gè)患者均未出現(xiàn)血管閉塞危象VOC，其中持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)的已有32.3個(gè)月未出現(xiàn)VOC。盡管機(jī)理尚不完全清晰，HbF能夠?qū)DT和SCD引起的貧血起到改善作用。Exa-cel治療后，TDT或SCD患者的HbF均有提升。Exa-cel治療后，含HbF的細(xì)胞比例明顯提升，TDT組由基線的約10%提升至90%-100%區(qū)間，SCD組由基線的約20%提升至90%-100%。且提升后比例穩(wěn)定維持在高位區(qū)間，TDT組最長(zhǎng)觀察期已達(dá)36個(gè)月，SCD組30個(gè)月。同時(shí)基因編輯已反映在骨髓（bonemarrow，CD3