分子生物學(xué)：生物分子（核酸）雜交技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)在分子水平上研究生命現(xiàn)象的科學(xué)生物大分子(核酸、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)、功能和生物合成等方面來闡明各種生命現(xiàn)象并加以應(yīng)用（疾?。┘夹g(shù)解決問題的方法及其原理生物大分子（基因）獲取與鑒定技術(shù)核酸與蛋白質(zhì)分離純化、基因文庫、測序、分子雜交基因的擴(kuò)增（DNA克隆-重組DNA，PCR)高通量（芯片）功能研究技術(shù)超表達(dá)，觀察表型、RNAi干擾技術(shù)生物大分子相互作用（酵母雙雜交、CHIP、EMSA)蛋白表達(dá)與抗體制備蛋白在細(xì)胞中的定位基因編輯技術(shù)（crispr/cas9，NgAgo-gDNA？）應(yīng)用基因診斷與基因治療生物分子（核酸）雜交技術(shù)Nucleicacidhybridization分子雜交概述核酸探針雜交信號的檢測核酸分子雜交的類型核酸分子雜交實驗的影響因素與優(yōu)化內(nèi)容芯片技術(shù)第一節(jié)分子雜交概述加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性變性是指某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

復(fù)習(xí)DNA變性的方法：熱變性：溫度升高到90~100℃酸堿變性：pH值低于3或高于10化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等變性后的理化性質(zhì)變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加（增色效應(yīng)）復(fù)習(xí)增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)：DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。DNA解鏈時的紫外吸收變化復(fù)習(xí)DNA的解鏈曲線(溶解曲線)連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度相對于A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線解鏈過程中，紫外吸光度的變化達(dá)到最大變化值的一半時所對應(yīng)的溫度。解鏈溫度(meltingtemperature，Tm)復(fù)習(xí)影響Tm值的因素：Tm不是一個固定的數(shù)值，它與很多因素有關(guān)：外部因素：pH、離子強(qiáng)度。隨著溶劑內(nèi)離子強(qiáng)度上升，Tm值也隨著增大。內(nèi)部因素：DNA的堿基比例、DNA的均一性；在相同條件下，DNA內(nèi)G-C配對含量高，其Tm值也高。

復(fù)習(xí)復(fù)性過程單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列形成完整的雙鏈分子影響復(fù)性速度的因素

DNA濃度DNA片段的大小溫度溶液的離子強(qiáng)度DNA順序的復(fù)雜性核酸的分子雜交

將帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段就會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。雜化雙鏈(heteroduplex)

核酸分子雜交技術(shù)

具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。雜交的雙方是待測核酸（目的基因）和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。探針(序列已知，單鏈)待測核苷酸序列(單鏈)

核酸分子雜交技術(shù)1961年,Hall等-------液相雜交探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心分離雜交體1962年,Bolton等設(shè)計了第一種簡單的固相雜交方法，稱為DNA-瓊脂技術(shù)。變性DNA固定在瓊脂中，DNA不能復(fù)性，但能與其它互補核酸序列雜交。用放射性標(biāo)記的短DAN或RNA分子與膠中DNA雜交過夜，然后將膠置于柱中進(jìn)行漂洗，去除游離探針，在高溫、低鹽條件下將結(jié)合的探針洗脫，洗脫液的放射性與結(jié)合的探針量呈正比。

核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展歷程

核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展歷程60年代末，Britten等設(shè)計了另一種分析細(xì)胞基因組的方法。從不同生物體（細(xì)菌、酵母等）內(nèi)分離DNA，用水壓器剪切成長約450核苷酸（nt）的片段。剪切的DNA液，經(jīng)煮沸使dsDNA熱變性成ssDNA。然后冷至約60℃，在此溫度孵育過程中，測定溶液一定時間內(nèi)的UV260nm的吸光度（減色效應(yīng)）來監(jiān)測互補鏈的復(fù)性程度。第二節(jié)核

酸

探

針

（Probe）探針從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)。探針技能，它是指利用標(biāo)記分子對其它分子的識別性而實現(xiàn)對其它分子進(jìn)行檢測的一種技能含標(biāo)記物的分子-----探針用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

核酸探針技術(shù)DNA探針最常用，長度在幾百堿基對以上的單鏈或雙鏈DNA基因組DNA探針：如病毒DNAcDNA探針：互補于mRNA的DNA分子,最常用寡核苷酸探針：10-50bp，測序、點突變RNA探針特異性強(qiáng)，但RNA極易降解，不宜操作核酸探針的種類DNA探針的特點：探針多已克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。能用于同位素和非同位素標(biāo)記。DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法等探針標(biāo)記

標(biāo)記物是什么？怎樣加上去？（探針標(biāo)記法）如何檢測雜交信號檢測探針標(biāo)記物理想探針標(biāo)記物應(yīng)具備的特性：高度靈敏性不影響堿基配對的特異性不影響探針分子的主要理化性質(zhì)對酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性放射性標(biāo)記物非放射性標(biāo)記物放射性標(biāo)記物

----放射性核素放射性核素能產(chǎn)生射線,將核素標(biāo)記在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通過一定方法摻入到DNA或RNA中去制成探針，與待測的核酸雜交后，核素產(chǎn)生的或射線可使底片感光的特性，通過放射自顯影的方法進(jìn)行檢測。產(chǎn)生射線的核素：32P、3H、35S,如：[32P]dATP產(chǎn)生射線的核素：125I32P：產(chǎn)生

射線，靈敏度高，分辨率強(qiáng)，是最常用的放射性標(biāo)記物，但半衰期短（14.3天），位和位標(biāo)記。35S：分辨率高、半衰期長（87.1天），敏感度低常用的放射性核素放射性污染成本高：半衰期短，不能長期保存放射性標(biāo)記物的缺點半抗原：地高辛配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，生物素?；膲A性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光常用的非放射性標(biāo)記物

地高辛甙元又稱異羥基洋地黃毒甙元，是一種類固醇半抗原分子采用人工方法可以將地高辛的線型間隔臂與dUTP連接起來,形成DIG-11-dUTPDIG-11-dUTP-----通過一定方法摻入到DNA中去制成探針----雜交----加抗地高辛-酶的復(fù)合物----加底物顯色靈敏度較高：0.1pg特異性較生物素高是較理想的非放射性標(biāo)記物地高辛甙元生物素：1-2pg生物素化核苷酸----通過酶觸反應(yīng)摻入到DNA中去制成探針----雜交----生物素-抗生物素蛋白-酶的復(fù)合物----加底物顯色生物素化核苷酸：bio-16-dUTPbio-11-dUTP光敏生物素：生物素與光敏基團(tuán)結(jié)合----光敏生物素-----光敏生物素與核酸探針混合----在強(qiáng)光的作用下----光敏基團(tuán)與核酸共價結(jié)合---生物素標(biāo)記的探針生物素化的核苷酸和

光敏生物素生物素光敏基團(tuán)優(yōu)點無放射性污染成本低、操作簡單缺點敏感性、特異性均低于放射性核素非放射性標(biāo)記物探針標(biāo)記方法體內(nèi)標(biāo)記法：將核素標(biāo)記的化合物作為合成代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時使核素?fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又?，?H-胸苷可摻入到DNA中，3H-尿苷可摻入到RNA中

探針體外標(biāo)記法化學(xué)標(biāo)記法標(biāo)記物分子上的活性基因與探針分子上的某些基因反應(yīng)，標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上酶促標(biāo)記法標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸摻入到探針上

探針的酶促標(biāo)記法缺口翻譯法（nicktranslation）或切口平移隨機(jī)引物法（randompriming)末端標(biāo)記法(end-labeling)其他PCR標(biāo)記法cDNA探針的標(biāo)記（反轉(zhuǎn)錄制備單鏈cDNA探針）RNA探針的標(biāo)記（體外轉(zhuǎn)錄的方法）323個氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

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核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實驗室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

切口平移法（nicktranslation)利用DNaseI在DNA雙鏈上造成單鏈切口利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的5