碩士研究生課-高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件

Chaper4DNA測(cè)序及基因組測(cè)序策略Chaper4DNA測(cè)序及基因組測(cè)序策略1結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的核心內(nèi)容之一是基因組測(cè)序。隨著人類基因組圖譜的完成,人類基因的定位克隆、鑒定分析直至全基因組測(cè)序均取得了突破性進(jìn)展,測(cè)序策略的成熟、測(cè)序方法的改進(jìn)、自動(dòng)測(cè)序儀的廣泛應(yīng)用、計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的擴(kuò)展以及測(cè)序分析能力的提高,大大推進(jìn)了大規(guī)模DNA測(cè)序的進(jìn)程。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的核心內(nèi)容之一是基因組2DNA測(cè)序的基本方法■鏈終止法測(cè)序■化學(xué)降解法測(cè)序■自動(dòng)化測(cè)序1非常規(guī)DNA測(cè)序DNA測(cè)序的基本方法31、鏈終止法測(cè)序(thechainterminationmethod1)基本原理1977年Sanger提出了“終止法”。其反應(yīng)體系包含單鏈模板、引物、4種dNTP和DNA聚合酶,分四組進(jìn)行,每組按一定比例加入一種2’,3'雙脫氧核苷三磷酸,它能隨機(jī)摻入合成的DNA鏈,一旦摻入合成即終止,于是各種不大小片段的末端核苷酸必定為該核苷酸,經(jīng)變性膠電泳,可從自顯影圖譜上直接讀出DNA序列1、鏈終止法測(cè)序(thechainterminatio4dNTPOHPP-P-ICHOHDMA聚合酶P一口口ooH—口口口口口口口合日日PP口口口口口Ⅷ0參入0口口口口口口q日日合P路止PP-PP—口口了口口姍0班·Klenow*段0H-口口口口口口q口合PdeNT參入P口口口口而■0口口口口口口口日日PP一口畫■KLenow序段0H口口口口口口口口口口PdNTPOH52)技術(shù)路線與要求制備單鏈模板克隆于質(zhì)粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈D將單鏈模板與一小段引物退火噬?？寺NADPCR產(chǎn)生單鏈DNAA高酶活性加入DNA多聚酶B無(wú)5→3外切酶活性4種脫氧核苷酸C無(wú)3'→5外切酶活性ddATP/ddcTP/ddGTP/分別加入少量4種雙脫氧核苷酸dP的3碳原子連接的是氫原子,不是羥基將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列2)技術(shù)路線與要求6引物鏈模板鏈①將反應(yīng)分為4組,每組均加入有放射性標(biāo)記的4種dNTPdCTP.dGTP.dTP,dmP②每組分別加入各自的A組G組組dNTP如組加入dTP●dP+ddTTPaAmT∞趾H:F"③如果遇到ddNTPDNA合成c終止于是在各組中產(chǎn)生長(zhǎng)短"不同的以該坦dNTP結(jié)束的DNA片段長(zhǎng)片段在上④反應(yīng)結(jié)東,迸行凝膠電泳A然后用Ⅹ膠片對(duì)其曝光短片段在下5⑤顯影然后自膠片上自下而上于的排好字母順序,這個(gè)序列就是DNA5→3的堿基順序引物鏈7化學(xué)降解法測(cè)序(Maxan和Gibert于1977年發(fā)明1)基本原理:在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)基團(tuán),再用化合物處理,使DNA分子在被修飾的位置降解化學(xué)降解法測(cè)序(Maxan和Gibert于8)技術(shù)路線將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂溍總€(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體電泳讀取DNA的核苷酸順序)技術(shù)路線93)Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)技術(shù)①先用限制性內(nèi)切酶把DNA切成10200bp的測(cè)序材料;②用堿性磷酸化酶處理該片段,消除5末端上的磷酸;③在5oH端標(biāo)記32P,用多核苷酸磷酸激酶催化;④標(biāo)記片段變性為單鏈;⑤用特異的化學(xué)試劑作用于不同的堿基進(jìn)行修飾,然后用哌啶切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈,緊接著用四組不同的特異反應(yīng)可以使末端標(biāo)記的DN切成不同長(zhǎng)度的片段生一組其末端都是該特異堿基的長(zhǎng)度不等的DNA片段⑥經(jīng)電泳和放射性自顯影后,從4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)統(tǒng)一閱讀,待測(cè)DNA的全部核苷酸序列就可直接讀出3)Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)技術(shù)10碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件11碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件12碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件13碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件14碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件15碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件16碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件17碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件18碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件19碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件20碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件21碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件22碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件23碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件24碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件25碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件26碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件27碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件28碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件29碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件30碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件31碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件32碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件33碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件34碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件35碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件36碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件37碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件38碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件39碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件40碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件41碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件42碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件43碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件44碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件45碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件46碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件47碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件48碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件49碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件50碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件51碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件52碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件53碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件54碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件55碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件56碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件57碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件58碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件59碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件60碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件61碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件62碩士研究生課——高級(jí)生物化學(xué)-DNA測(cè)序及基因組課件63碩士研究生課——高