園藝植物生物技術(shù)第二章 園藝植物脫毒

第二章園藝植物脫毒與離體快速繁殖第一節(jié)園藝植物病毒病的危害多數(shù)無性繁殖的園藝植物易受到病毒的侵染，病毒侵染可經(jīng)帶毒的無性繁殖材料傳至下一代，并逐漸積累，導(dǎo)致植物種性退化，造成作物產(chǎn)量下降或品質(zhì)降低甚至死亡。由病毒引起的植物病害稱為植物病毒病(Plantvirusdisease)

一、植物病毒的概念與形態(tài)

早在17世紀(jì)初，郁金香等植物表現(xiàn)花葉、黃化、矮縮等癥狀，當(dāng)時(shí)人們把這些異?，F(xiàn)象，都?xì)w諸于生理的或遺傳的原因，或其他毒素的作用。1886年，德國人Mayer發(fā)現(xiàn)，把煙草花葉病植株的汁液,接種到無病煙草上，可以使健康植株發(fā)病，于是他斷定煙草花葉病是由細(xì)菌引起的。1892年，伊萬諾夫斯基（俄國）發(fā)現(xiàn)，煙草花葉病的病原物可以通過細(xì)菌不能通過的微孔漏斗，因此他認(rèn)為煙草花葉病的病原不是細(xì)菌，而是一種“傳染性活液”。1898年，荷蘭人Beijerind把這種“傳染性活液”定名為病毒（virus)。其后又經(jīng)過近40年，美國的Stonley(1935)把煙草花葉病毒提純，得到它的結(jié)晶體，證實(shí)病毒是一種含有核酸的蛋白質(zhì)，并逐步明確病毒是由一種核酸和蛋白質(zhì)衣殼組成，非細(xì)胞形態(tài)的分子生物。病毒是一種非細(xì)胞形態(tài)的專性寄生物，僅含有一種核酸(RNA或DNA）和蛋白質(zhì)，必須在活細(xì)胞中才能增殖。病毒粒體有桿狀、線狀、球狀3種。不同形態(tài)的病毒其大小也不同，計(jì)量單位用納米（nm）表示。病毒是介于生命與非生命之間的一種物質(zhì)形式，因此我們說它是邊緣生命。病毒存在于環(huán)境之中，游離于細(xì)胞之外時(shí)，不能復(fù)制，只以一種有機(jī)物的物質(zhì)形式存在。但病毒進(jìn)入細(xì)胞之后，它可以控制細(xì)胞，使其聽從病毒生命活動需要，表現(xiàn)它的生命形式。因此，病毒是由一個(gè)或幾個(gè)核酸分子組成的基因組，有一層蛋白或脂蛋白保護(hù)性外殼，且可在一定宿主細(xì)胞中自我復(fù)制的感染性因子。病毒的生命形式極其經(jīng)濟(jì)，因?yàn)榛蚪M中的每個(gè)核苷酸均有用。病毒最明顯的特點(diǎn)是病毒極其自私，復(fù)制原料和能量全部來自它所寄生的細(xì)胞，并使細(xì)胞產(chǎn)生病變。在進(jìn)化過程中，它會與細(xì)胞和平共處，便于更好利用細(xì)胞的資源，但是病毒引起的病害常常是突發(fā)性的。如人類的腫瘤，往往是多年潛伏，一旦條件適合或受到外界刺激利于病毒的增殖，病毒就會突然致病。然而病毒可以被改造和利用，如基因治療的在基因工程中用做載體。

HIVSARS二、園藝植物病毒病的危害特點(diǎn)園藝植物的特點(diǎn)：種類和繁殖方式多樣性蔬菜：一年生為主，種子、塊莖、鱗莖；寄主復(fù)雜，媒體傳播、種子傳播果樹：一旦感染終生帶毒；無性繁殖系數(shù)決定了病毒傳播速度；病毒侵染破壞正常代謝，導(dǎo)致樹體衰退；表現(xiàn)：削弱生長勢，降低產(chǎn)量、品質(zhì)、價(jià)值，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。園藝植物病毒病的嚴(yán)重性

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，草莓能感染62種病毒和類菌質(zhì)體。核果類病毒達(dá)90多種。馬鈴薯病毒達(dá)30余種，蘋果也有30多種病毒侵染，柑桔有20多種病毒，觀賞植物的病毒病達(dá)100多種。癥狀表現(xiàn):

在田間，病株較健株生長矮小且衰弱，葉色淡。病株嫁接口周圍腫大。木質(zhì)部表面產(chǎn)生深褐色凹陷裂溝。癥狀表現(xiàn):

病葉片上產(chǎn)生淡綠色或淺黃色環(huán)斑，發(fā)生無規(guī)律，有時(shí)病斑只發(fā)生在主脈或側(cè)脈的周圍。高度感病品種的病葉往往變形或卷曲。病斑偶爾也發(fā)生在果實(shí)上，但病果不變形果肉組織也無明顯損傷。有些品種無明顯癥狀，或僅有淡綠色或黃綠色小斑點(diǎn)組成的輕微斑紋。陽光充足的夏季癥狀明顯，而且感病品種的葉片上常出現(xiàn)壞死區(qū)域。多雨季節(jié)或陽光不充足時(shí)，癥狀輕微。帶毒梨樹的干周生長量減少10%，新稍生長量和葉面積減少20%，樹勢衰弱且易遭凍害。水稻矮小病毒花生矮縮病毒棗樹病毒病：示病樹干部皮層扭曲示皮層內(nèi)的黑褐色“木刺”番茄條斑型病毒病病果

大白菜病毒病又叫孤丁病、抽瘋病，苗期發(fā)病心葉呈明脈或葉脈失綠，后產(chǎn)生濃淡不均的綠色斑駁或花葉。成株期發(fā)病早的，葉片嚴(yán)重皺縮，質(zhì)硬而脆，常生許多褐色小斑點(diǎn)，葉背主脈上生褐色稍凹陷壞死條狀斑，植株明顯矮化畸形，不結(jié)球或結(jié)球松散。甜菜黃化病毒大蔥萎縮病毒三、園藝植物病毒病的傳播途徑及防治傳播途徑：介體傳播：昆蟲，線蟲，螨蟲接觸傳播：汁液，人為，嫁接防治：栽培無病毒苗木；加強(qiáng)檢疫；防治傳毒蟲媒；抗病毒基因工程。四、園藝植物脫毒技術(shù)脫毒的意義應(yīng)用植物脫毒技術(shù)培育無病毒苗可以使品種復(fù)壯，增強(qiáng)適應(yīng)能力和抗逆能力，明顯提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。脫毒方法1.莖尖培養(yǎng)脫毒2.微體嫁接脫毒3.熱處理脫毒4.熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒5.抗病毒藥劑脫毒

1.莖尖培養(yǎng)脫毒

又稱為分生組織培養(yǎng)（meristemculture）1934年，White發(fā)現(xiàn)TMV在煙草根中的分布是不均勻的，越靠根尖區(qū)病毒含量越低，在根尖的頂端不含病毒。1949年，Limasset和Cornuet莖尖分生組織葉不帶病毒。1952年，Morel和Martin首先利用莖尖分生組織培養(yǎng)獲得了大麗花和馬鈴薯無病毒苗，同時(shí)建立了莖尖脫毒的組織培養(yǎng)技術(shù)體系。2001年，Ayabe和Sumi報(bào)道利用大蒜莖片生長點(diǎn)培養(yǎng)脫除病毒的方法。病毒在植物體內(nèi)分布不均勻的機(jī)理目前還不十分清楚，但根據(jù)病毒及分生組織的特性，學(xué)者們提出了一些假說，主要有以下幾種：能量競爭病毒核酸和植物細(xì)胞分裂時(shí)，DNA合成均需要消耗大量的能量。傳導(dǎo)抑制1966年Quak：病毒傳播主要是通過微管束，但分生組織中胞間連絲和微管組織還不健全。激素抑制1977年，Quak：分生組織中高濃度的生長素和細(xì)胞分裂素阻滯了病毒的侵入或抑制了病毒活性。酶缺乏1969年Stace－Smith認(rèn)為病毒合成可能需要酶的參與。抑制因子1976年Martin－Tanguy認(rèn)為分生組織中自然存在某種抑制因子。莖尖脫毒培養(yǎng)繁育程序通常莖尖培養(yǎng)脫毒效果的好壞與莖尖大小呈負(fù)相關(guān)，而培養(yǎng)莖尖成活率的高低則與莖尖的大小呈正相關(guān)。一般切取0.2~0.5mm，帶一兩個(gè)葉原基的莖尖作為培養(yǎng)材料較好。2.微體嫁接脫毒（micrograftingofshoottip）微體嫁接是組織培養(yǎng)與嫁接方法相結(jié)合來獲得無病毒苗木的一種新技術(shù)。它是將極?。?.1~0.2mm)的莖尖作為接穗，嫁接到由試管中培養(yǎng)出來的無菌實(shí)生砧木上，繼續(xù)進(jìn)行試管培養(yǎng)，愈合成為完整的植株而達(dá)到脫毒的效果。2.微體嫁接脫毒（micrograftingofshoottip）影響微體嫁接成活的因素主要是接穗的大小和取樣時(shí)間。一般春天從新梢上取材嫁接的成活率顯著高于其他季節(jié)取材的成活率。微體嫁接技術(shù)難度較大，不易掌握，與實(shí)際應(yīng)用還有相當(dāng)距離。但隨著新技術(shù)的發(fā)展與完善，微體嫁接技術(shù)也會有很大發(fā)展。3、熱處理脫毒發(fā)現(xiàn)：1889年，印度尼西亞爪哇將患枯萎病的甘蔗放在50~52℃熱水中30min，甘蔗就可去病生長良好通過熱處理（heattreatment），又稱溫?zé)岑煼ǎ╰hermotherapy），可由受侵染的個(gè)體得到無病毒植株。利用植物和病毒的耐熱性不同，在高于正常溫度的環(huán)境條件下，植物組織中的很多病毒受熱后可被部分或全部鈍化或失去活性，而寄主植物組織很少或不會受到傷害；或在高溫條件下，植物的生長加快，病毒的增殖速度跟不上植物的生長速度而被拋在其后，使植物的新生部分不帶病毒。

熱處理的方法熱水浸泡：

是將剪下的接穗或種植材料，在50~55℃的熱水中浸泡數(shù)分鐘或35℃溫水處理30-40h,方法簡便，但易使材料受損傷，到55℃時(shí)則大多數(shù)植物會被殺死。該方法適合甘蔗、木本植物和休眠芽。

高溫空氣

是將旺盛生長的植物在35~40℃條件下生長發(fā)育，處理時(shí)間的長短，因病毒種類不同可由數(shù)分鐘到數(shù)周不等，熱處理之后要立即把莖尖切下來嫁接到無病的砧木上或進(jìn)行組培。該方法對活躍生長的莖尖效果較好，既能消除病毒，又能使寄生植物有較高的存活機(jī)會，目前熱處理大多采用這種方法。缺陷：熱處理只對那些球狀的病毒(如葡萄扇葉病毒、蘋果花葉病毒)或線狀的病毒(如馬轉(zhuǎn)薯X，Y病毒、康乃馨病毒)有效果，而對桿狀病毒(如牛蒡斑駁病毒、千日紅病毒)不起作用。香石竹在38－40℃條件下經(jīng)兩個(gè)月處理可除去全部病毒。菊花在35℃－38℃的條件下處理60d可使病毒失活。馬鈴薯在37℃條件下處理10－20d能除去卷葉病毒。柑橘黃化病毒30℃－40℃條件下處理7－12周。4.熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)或微嫁接技術(shù)脫毒

將熱處理與莖尖分生組織培養(yǎng)結(jié)合起來，則可以取稍大的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，這樣能夠大大提高莖尖的成活率和脫毒率。5.抗病毒藥劑脫毒

在莖尖培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)中，在培養(yǎng)基內(nèi)加用抗病毒醚(ribavirin)，能抑制病毒復(fù)制。山家弘士(1986)發(fā)現(xiàn)抗病毒醚對蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)和蘋果莖溝病毒(ASGV)，在蘋果植株體內(nèi)都有抑制增殖效果。目前用此法也不可能脫除所有病毒，如果使用不當(dāng)，藥害現(xiàn)象比較嚴(yán)重，此種脫毒處理還處于探索階段。五脫毒苗的鑒定及檢測技術(shù)脫毒效果的檢測1、形態(tài)檢測法脫毒苗葉色濃綠，均勻一致，長勢好2、指示植物法指示植物法是利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑和某些病理癥狀，作為鑒別病毒及病毒種類的標(biāo)準(zhǔn)，也叫枯斑或空斑測定法。接種某種病毒后能快速表現(xiàn)特有癥狀的植物稱為指示植物（indicatorplant），又稱鑒別寄主。2、接種方法汁液摩擦接種法嫁接法：小葉嫁接法雙重芽嫁接法雙重切接法指示植物直接嫁接法汁液摩擦接種法：從被鑒定植物上取1~3g幼葉→研碎→過濾→取濾液涂抹于指示植物的葉面上（金剛砂）→保溫15~25℃→接種后2~6d可見癥狀出現(xiàn)。血清學(xué)鑒定植物病毒是由蛋白質(zhì)和核酸組成的核蛋白(抗原antigen)，給動物注射后會產(chǎn)生一種相應(yīng)的免疫球蛋白，稱為抗