專題1 1.2 基因工程的基本操作程序

理解教材新知專題11.2把握熱點(diǎn)考向應(yīng)用創(chuàng)新演練知識(shí)點(diǎn)一知識(shí)點(diǎn)三考向一考向二考向三知識(shí)點(diǎn)二1．獲取目的基因的常用方法有：從基因文庫(kù)

中獲取目的基因和利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基

因。

2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實(shí)施基因工程的

第二步，也是基因工程的核心。

3．一個(gè)基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動(dòng)子、終止子以及標(biāo)記基因等。4．將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。5．培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，受體細(xì)胞一般是受精卵，目的基因的導(dǎo)入方法常用顯微注射技術(shù)。6．檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入和轉(zhuǎn)錄，常用分子雜交技術(shù)；檢測(cè)是否翻譯，常用抗原—抗體雜交技術(shù)。[自讀教材·夯基礎(chǔ)]1．目的基因

(1)主要是指

的基因。

(2)也可以是一些具有

的因子。

2．獲取方法

(1)從基因文庫(kù)中獲取：①基因文庫(kù)的含義：將含有某種生物不同基因的許多

，導(dǎo)入

的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因。編碼蛋白質(zhì)調(diào)控作用DNA片段受體菌(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：①原理：

。②前提條件：有一段已知目的基因的

，以便根據(jù)這一序列合成

。③條件：DNA模板、

、

和4種脫氧核苷酸。DNA復(fù)制核苷酸序列引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶引物④擴(kuò)增過(guò)程：受熱引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶（3）1．探討基因文庫(kù)、基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)之間的關(guān)系。

提示：基因組文庫(kù)含有一種生物的全部基因，而cDNA文庫(kù)只含有一種生物的部分基因，二者都是基因文庫(kù)。

2．從酶的角度分析PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA與DNA體內(nèi)復(fù)制的不同點(diǎn)。

提示：①PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA不需要解旋酶；②PCR技術(shù)需要的DNA聚合酶應(yīng)具有熱穩(wěn)定性。[跟隨名師·解疑難]1．提取目的基因方法的比較方法基因文庫(kù)的構(gòu)建PCR技術(shù)擴(kuò)增人工合成基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)(如cDNA文庫(kù))過(guò)程供體細(xì)胞中的DNA

↓限制酶許多DNA片段

↓連接表達(dá)載體↓導(dǎo)入受體細(xì)胞↓外源DNA擴(kuò)增，產(chǎn)生特定性狀↓分離目的基因目的基因的mRNA

↓反轉(zhuǎn)錄單鏈DNA↓合成雙鏈DNA↓插入載體↓導(dǎo)入受體菌群(cDNA文庫(kù))↓分離目的基因目的基因DNA

高溫解鏈單鏈DNA

與引物結(jié)合、DNA聚合酶大量目的基因蛋白質(zhì)的氨基酸序列↓推測(cè)mRNA的核苷酸序列↓推測(cè)基因的核苷酸序列

化學(xué)合成目的基因方法基因文庫(kù)的構(gòu)建PCR技術(shù)擴(kuò)增人工合成基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)(如cDNA文庫(kù))優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單專一性強(qiáng)可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)，可產(chǎn)生自然界中不存在的新基因缺點(diǎn)工作量大、盲目性大、專一性差操作過(guò)程較麻煩，技術(shù)要求過(guò)高需要嚴(yán)格控制溫度，技術(shù)要求高適用范圍小2．PCR技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫作用下變性解旋場(chǎng)所細(xì)胞內(nèi)(主要在細(xì)胞核內(nèi))細(xì)胞外(主要在PCR擴(kuò)增儀內(nèi))酶DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐熱的DNA聚合酶(Taq聚合酶)溫度條件細(xì)胞內(nèi)溫和條件需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行合成的對(duì)象DNA分子DNA片段或基因聯(lián)系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進(jìn)行物質(zhì)合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進(jìn)行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸[特別提醒](1)基因工程操作中，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才比較有利于基因的表達(dá)。

(2)通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞中無(wú)法轉(zhuǎn)錄。

(3)熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq聚合酶)能在高溫下保持其活性，是PCR技術(shù)關(guān)鍵的工具之一。[自讀教材·夯基礎(chǔ)]1．基因表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中

，并且可以遺傳和

。

(2)組成：穩(wěn)定存在表達(dá)2．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

(1)導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法：T-DNA雙子葉植物裸子②

：常用于單子葉植物。③花粉管通道法：目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。(2)導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞：①方法：

技術(shù)。②常用受體細(xì)胞：

。植物基因槍法顯微注射受精卵(3)導(dǎo)入微生物細(xì)胞：①原核生物特點(diǎn)：

、多為

、遺傳物質(zhì)相對(duì)

等。②方法：感受態(tài)細(xì)胞法，即用

處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細(xì)胞稱為

)。繁殖快單細(xì)胞Ca2＋較少感受態(tài)細(xì)胞1．思考基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要哪些工具酶。提示：限制酶、DNA連接酶。

2．結(jié)合教材P13資料卡分析，用花粉管通道法導(dǎo)入受體細(xì)胞的目的基因是否需要和載體結(jié)合？試分析原因。提示：需要。因?yàn)槟康幕蛑挥泻洼d體結(jié)合成基因表達(dá)載體才容易在受體細(xì)胞中穩(wěn)定維持和表達(dá)。

3．為什么動(dòng)物的體細(xì)胞不能作為受體細(xì)胞？提示：動(dòng)物體細(xì)胞全能性受到限制，不能發(fā)育為一個(gè)新個(gè)體。[跟隨名師·解疑難]1．基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成一個(gè)重組DNA分子(重組質(zhì)粒)。構(gòu)建過(guò)程如圖所示：2．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法比較受體細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上↓轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中↓導(dǎo)入植物細(xì)胞↓整合到受體細(xì)胞的DNA上提純含目的基因的表達(dá)載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個(gè)體Ca2＋處理細(xì)胞↓感受態(tài)細(xì)胞↓基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合↓感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子[特別提醒](1)完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建，需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，連接產(chǎn)物有目的基因—目的基因，目的基因—運(yùn)載體和運(yùn)載體—運(yùn)載體三種。

(2)將基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)導(dǎo)入農(nóng)桿菌的常用方法是Ca2＋處理法。Ca2＋(或CaCl2溶液)對(duì)微生物細(xì)胞的作用是增加細(xì)胞壁的通透性。[自讀教材·夯基礎(chǔ)]1．分子水平的檢測(cè)(連線)2．個(gè)體水平的鑒定(1)

的接種實(shí)驗(yàn)。(2)對(duì)基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行

?？瓜x(chóng)或抗病活性比較

1．檢測(cè)棉花中導(dǎo)入的抗蟲(chóng)基因是否表達(dá)的最簡(jiǎn)便的方法是什么？提示：用葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲(chóng)，觀察棉鈴蟲(chóng)是否死亡。

2．DNA分子雜交的原理是什么？有哪些應(yīng)用？提示：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則?？捎糜谟H子鑒定、刑事偵查、生物親緣關(guān)系確定等。[跟隨名師·解疑難]目的基因的檢測(cè)與鑒定歸納

[例1]為從根本上解決水稻中的高植酸問(wèn)題，可將植酸酶基因?qū)胨?，培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種。下圖是獲取植酸酶基因的流程。據(jù)圖回答：

(1)圖中基因組文庫(kù)________(填“小于”“等于”或“大于”)cDNA文庫(kù)。

(2)B過(guò)程需要的酶是__________；A、C過(guò)程中______(填“可以”或“不可以”)使用同一種探針篩選含目的基因的菌株。

(3)目的基因Ⅰ和Ⅱ除可從構(gòu)建的文庫(kù)中分離外，還可以分別利用圖中__________和__________為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該過(guò)程中所用酶的顯著特點(diǎn)是____________________。

[思路點(diǎn)撥][精講精析]

分析獲取植酸酶基因的流程圖可知，圖中基因組文庫(kù)大于cDNA文庫(kù)。B過(guò)程需要的酶應(yīng)該是逆轉(zhuǎn)錄酶；A、C過(guò)程雖然都能獲得含目的基因的菌株，但C中無(wú)內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的序列，所以不可以使用同一種探針進(jìn)行篩選。目的基因Ⅰ和Ⅱ除可從構(gòu)建的文庫(kù)中分離外，還可以分別利用圖中DNA和cDNA為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該過(guò)程中所用酶的顯著特點(diǎn)是耐高溫。

[答案]

(1)大于

(2)逆轉(zhuǎn)錄酶不可以

(3)DNA

cDNA耐高溫(2)表達(dá)：只有編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄生成RNA，且內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分要剪切掉，即轉(zhuǎn)錄生成的mRNA只有外顯子對(duì)應(yīng)部分。因此，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的目的基因中沒(méi)有內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子。下列關(guān)于cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)的說(shuō)法中，不正確的是(

)A．cDNA文庫(kù)中的DNA來(lái)源于mRNA的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程B．如果某種生物的cDNA文庫(kù)中的某個(gè)基因與該生物的基因組

文庫(kù)中的某個(gè)基因控制的性狀相同，則這兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)

也完全相同C．cDNA文庫(kù)中的基因都沒(méi)有啟動(dòng)子D．一種生物的cDNA文庫(kù)可以有許多種，但基因組文庫(kù)只有一

種解析：由于基因轉(zhuǎn)錄時(shí)只有編碼區(qū)段才能轉(zhuǎn)錄，所以以mRNA反轉(zhuǎn)錄成的DNA就只有外顯子區(qū)段，而缺少內(nèi)含子和啟動(dòng)子等非編碼區(qū)段，和原來(lái)的基因結(jié)構(gòu)不相同。答案：B.[例2]右圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，小箭頭所指分別為限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，ampr為青霉素抗性基因，tetr為四環(huán)素抗性基因，P為啟動(dòng)子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。據(jù)圖回答：