八生物藥物制備技術(shù)概論

第二章生物藥物制備技術(shù)概論第一節(jié)生物材料與生物活性物質(zhì)一、生物材料的來源供生產(chǎn)生物藥物的生物資源主要有動物、植物、微生物的組織、器官、細(xì)胞與代謝產(chǎn)物。應(yīng)用動植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物發(fā)酵技術(shù)也是獲得生物制藥原料的重要途徑。基因工程技術(shù)與細(xì)胞工程技術(shù)和酶工程技術(shù)更是開發(fā)生物制藥資源的新途徑。（一）動物臟器（1）胰臟（激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）（2）腦（腦磷脂、肌醇磷脂、神經(jīng)磷脂、神經(jīng)肽等）（3）胃粘膜（胃蛋白酶、膠原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）（4）肝臟（維生素、磷脂類、膽固醇）（5）脾臟（免疫器官）（6）小腸（糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃腸道激素）（7）腦垂體（各種激素）（8)心臟（細(xì)胞色素C、輔酶Q10）其它等（二）血液、分泌物和其它代謝物血液制品：人血制劑、抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，纖維蛋白原，免疫球蛋白、人血漿、干擾素、白介素等。尿液、膽汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料，尿激酶，表皮生長因子、HCG（三）海洋生物（1）海藻（2）腔腸動物?？舅兀?）節(jié)肢動物甲殼素（4)軟體動物多糖、多肽、毒素（5）棘皮動物海星、海膽、海參海參素抗癌（6）魚類魚油、多種激素、毒素，硫酸軟骨素（7）爬行動物龜滋陰養(yǎng)腎抗腫瘤（8）海洋哺乳動物鯨魚魚肝油（四）植物生物堿、強(qiáng)心甙、黃酮、皂甙、揮發(fā)油、樹脂、鞣質(zhì)等。（五）微生物1.細(xì)菌常用細(xì)菌發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主要有：（1）氨基酸利用微生物酶可轉(zhuǎn)化對應(yīng)的α酮酸或羥基酸作用產(chǎn)生氨基酸。（2）有機(jī)酸檸檬酸、蘋果酸、乳酸（3）糖類利用細(xì)菌可制取葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。（4）核苷酸類用細(xì)菌可生產(chǎn)5‘－AMP，5’－肌苷酸（5）維生素VB1,VB2，VB6,Vc（6）酶淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、彈性蛋白酶2.放線菌放線菌是最重要的抗生素產(chǎn)生菌，已有1000多種抗生素約2/3產(chǎn)自放線菌。（1）氨基酸發(fā)酵法（2）核苷酸5-脫氧肌苷酸（3）維生素（4)酶3.真菌（1)酶（2）有機(jī)酸（3）氨基酸（4）核酸及有關(guān)物質(zhì)（5）維生素（6)促生素（7）多糖4.酵母菌（1）維生素（2）蛋白質(zhì)與多肽（3）核酸（六）開發(fā)生物新資源（1）動植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（2）應(yīng)用基因工程技術(shù)建立工程菌或工程細(xì)胞二、生物活性物質(zhì)的存在方式（一）生物活性物質(zhì)的存在方式與其生物功能根據(jù)生物活性物質(zhì)的生物功能推斷其存在部分和分布方式。生物活性物質(zhì)分為胞內(nèi)與胞外兩種存在部位。（二）生物分子間的作用力三、生物活性物質(zhì)的存在特點(diǎn)（一）生物材料組成的復(fù)雜性（二）生物活性物質(zhì)存在地特點(diǎn)生物活性物質(zhì)在生物材料中含量較低，雜質(zhì)含量很高，而且生理活性愈高，含量愈低。生物材料中的生化組成數(shù)量大，種類多，分離純化比較困難。四、生物材料的準(zhǔn)備生物材料的制造主要包括以下工藝過程：1)生物材料的選取與預(yù)處理；2)從生物材料中提取有效活性物質(zhì)；3)有效成分的分離，純化4)后處理及制劑（一）生物材料的選取1.有效成分的含量（1）生物品種根據(jù)目的物的分布，選擇富含有效成分的生物品種是選材的關(guān)鍵。（催乳素，哺乳動物）（2）合適的組織器官（胃蛋白酶，胃）（3）生物的生長期生物的生長期對生理活性物質(zhì)含量影響很大。2.雜質(zhì)情況難于分離的雜質(zhì)會增加工藝的復(fù)雜性，嚴(yán)重影響收率、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益。3.來源應(yīng)選用來源豐富的材料，盡量不與其他產(chǎn)品爭原料，最好能一物多用，綜合利用。胰臟制備彈性蛋白酶和激肽釋放酶，胰島素與胰酶等。（二）生物材料的采集與保存生理活性物質(zhì)易失活與降解，采集時必須保持材料的新鮮。防止腐敗、變質(zhì)與微生物污染。如胰臟采摘后要立即速凍，防止胰島素活力下降。保存生物材料的主要方法有速凍、凍干、有機(jī)溶劑脫水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮與甘油中等。（三）動物細(xì)胞的培養(yǎng)與保存（四）微生物菌種的選育與保存1.菌種的分離微生物種類繁多，易于培養(yǎng)，是工業(yè)化生產(chǎn)各種生物藥物的主要材料。（1）含菌樣品的收集根據(jù)微生物的生態(tài)特點(diǎn)，從自然界取樣，分離所需要菌種，如到堆積和腐爛纖維素的地方去取樣分離纖維素酶產(chǎn)生菌。到溫泉附近取樣分離高溫蛋白酶產(chǎn)生菌。一般可以從土壤中分離所需微生物，取樣時先將表土刮去2~3cm，在同一條件下選好2~5點(diǎn)土樣混在一起包好，表明采樣地點(diǎn)及日期備用。（2）富集培養(yǎng)收集到的樣品若含所需要的菌較多，可直接分離。如含所需要的菌很少，就需要經(jīng)過富集培養(yǎng)，使所需要的菌大量生長，以利于篩選。再配合控制溫度，pH或營養(yǎng)成分即可達(dá)到目的。有時用能分解的底物作為生長和誘導(dǎo)產(chǎn)生所須成分的培養(yǎng)基成分，以使所需要的菌種得到快速生長，有利于進(jìn)一步分離。（3）菌種純化在自然條件下，各種類型的菌混雜在一起生活，所以要進(jìn)行分離，以獲得純種。菌種純化的方法一般采用稀釋分離或劃線分離法。2.菌種的篩選（1）篩選對象的選擇篩選前，先要考慮哪些微生物是篩選的對象。如有報道，則根據(jù)文獻(xiàn)收集可能性最大的的微生物進(jìn)行篩選。（2）培養(yǎng)方式的確定微生物的培養(yǎng)方式，有固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)。3.菌株的選育從自然界直接分離得到的菌種，都不能立即適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)需要。只有通過誘變，選育才能使產(chǎn)量成倍，成百倍地提高。選育方法基本上可以分成兩類：隨機(jī)選擇突變體；根據(jù)代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制選擇各種突變體。（1）隨機(jī)選擇法一般程序是采用誘變劑誘變處理微生物，增殖培養(yǎng)，經(jīng)過稀釋涂布，隨機(jī)選擇部分或全部單菌落，逐個測定它們的生物活性。最后挑選出產(chǎn)量或其它性能比親代菌株優(yōu)秀的突變株。（2）根據(jù)代謝的調(diào)節(jié)機(jī)理選擇高產(chǎn)突變體根據(jù)代謝的調(diào)節(jié)機(jī)理選擇高產(chǎn)突變體。(抗性基因)4.菌種的保藏（1）菌種的退化與防止生產(chǎn)菌種本來在自然環(huán)境下生長，所以在人工培養(yǎng)條件下，任何菌株通過一系列的轉(zhuǎn)接傳代都可能發(fā)生退化。退化—一般把菌株的生活力，產(chǎn)孢子能力的衰退和特殊產(chǎn)物產(chǎn)量的下降，成為退化。菌種退化現(xiàn)象：①單位容積中發(fā)酵液的活性物質(zhì)含量；②瓊脂平皿上的單菌落形態(tài)；③不同培養(yǎng)時期菌體細(xì)胞的形態(tài)和主要遺傳特征。如形成孢子能力；④發(fā)酵過程pH變動情況；⑤發(fā)酵液的氣味、色澤。菌種退化防止措施：①防止基因突變，基因突變是菌種退化的一個主要原因，低溫保藏法可以減少突變得產(chǎn)生。②采用雙重缺陷型采用雙營養(yǎng)缺陷標(biāo)志可間接而有效地防止突變。③制定科學(xué)管理制度制作平行菌種斜面；④分離單菌落；認(rèn)真進(jìn)行單菌落分離工作，再多做平行的菌種斜面；⑤選擇培養(yǎng)條件選擇有利于高產(chǎn)菌株而不利于低產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件。（2）常用的菌種保藏方法斜面保存法—將菌種轉(zhuǎn)接到新鮮的瓊脂斜面上，待生長良好后，于4℃保存。根據(jù)具體情況，間隔一定時間后轉(zhuǎn)接。礦油法—在菌種斜面上覆蓋礦物油以隔絕空氣防止蒸發(fā)。索氏法—將小試管斜面的菌種放在大試管內(nèi)，大試管內(nèi)裝幾粒氫氧化鉀，管口加橡皮套，然后用石蠟包封。干硅膠法—試管內(nèi)裝硅膠約半滿，180℃加熱滅菌1.5小時，置密封干燥器內(nèi)冷卻，接種菌液約1ml，塞好棉花，放入預(yù)置有色硅膠的大瓶中，蠟封瓶口，于低溫處保存。砂土管法—取普通黃沙，洗凈過60目篩，曬干，另取普通圓土研碎，過篩，曬干。兩者以6:4混合。分裝于安醅瓶或小試管中，然后在60℃干熱滅菌2小時，連續(xù)滅菌三次后即可使用。裝管時可吸取少許孢子懸浮液加入，待干燥后抽真空封口或用棉花塞緊后蠟封，低溫保藏。冷凍干燥法：將菌種懸浮于脫脂消毒牛奶中，快速冷凍，真空干燥。甘油冷凍保存法：將對數(shù)期菌體懸浮于新鮮培養(yǎng)基中，加入15%消毒甘油，混勻速凍，凍存于－70~－80℃.（五）組織與細(xì)胞的破碎組織與細(xì)胞的破碎方法有物理法、化學(xué)法與生物法。1.物理法（1）磨切法工業(yè)上常用的有絞肉機(jī)，刨胰機(jī)，球磨機(jī)、磨粉機(jī)。實(shí)驗(yàn)室常用的有勻漿機(jī)，研缽，高速組織搗碎機(jī)。（2）壓力法有壓榨法、高壓法和減壓法，滲透壓法。（3）超聲波法（4）反復(fù)凍融法2.化學(xué)法用稀酸、稀堿、濃鹽、有機(jī)溶劑或表面活性劑處理細(xì)胞，可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)釋放出內(nèi)容物。3.生物法（1）組織自溶法利用組織中自身溶解酶的作用改變、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放出目的物稱為組織自溶法。(2)酶解法用外來酶處理生物材料，如用溶菌酶處理某些細(xì)菌，蝸牛酶等（3）噬菌體法用噬菌體感染細(xì)胞、裂解細(xì)胞，釋放出內(nèi)容物。（六）細(xì)胞器的分離為獲得結(jié)合在細(xì)胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到細(xì)胞器再進(jìn)一步分離有效成分。方法是勻漿破碎細(xì)胞，差速離心。第二節(jié)生物活性物質(zhì)的提取提取是利用制備目的物的溶解特性，將目的物與細(xì)胞的固形物成分或其它結(jié)合成分分離，使其由固相轉(zhuǎn)入液相或從細(xì)胞生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入特定溶液環(huán)境的過程。一、物質(zhì)性質(zhì)與提?。ㄒ唬┪镔|(zhì)的性質(zhì)與提取方法的選擇要取得好的提取效果，最重要的是要針對生物材料和目的物的性質(zhì)選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。生物材料及其目的物與提取有關(guān)的一些性狀包括溶解性質(zhì)、分子量、等電點(diǎn)、存在方式、穩(wěn)定性、比重、粒度、粘度，目的物含量，主要雜質(zhì)種類及溶解性質(zhì)，有關(guān)酶的特征等。其中最主要的是目的物與主要雜質(zhì)在溶解度方面的差異以及它們的穩(wěn)定性。操作者可根據(jù)文獻(xiàn)資料及本人的試驗(yàn)摸索獲得的有關(guān)信息，在提取過程中增加目的物的溶出度，盡可能減少雜質(zhì)的溶出度。（二）活性物質(zhì)的保護(hù)措施（1）采用緩沖鹽系統(tǒng)在生物藥物制備中，常用的緩沖鹽有磷酸緩沖鹽，檸檬酸緩沖鹽，Tris緩沖液，醋酸緩沖鹽，碳酸緩沖鹽，硼酸緩沖鹽和巴比妥緩沖鹽等。（2）添加保護(hù)劑防止某些生理活性物質(zhì)的活性基團(tuán)及酶的活性中心受到破壞，如巰基是許多活性蛋白質(zhì)和酶催化活性基團(tuán)，極易被氧化，故提取時，常添加某些還原劑如半胱氨酸，－巰基乙醇。對易受重金屬影響的，可添加EDTA。（3）抑制水解酶的作用（4）其它保護(hù)措施（冷、熱、酸、堿）二、物質(zhì)的性質(zhì)與溶解度（一）物質(zhì)溶解度的一般規(guī)律相似相溶（二）水在生化物質(zhì)提取中的作用水是提取生化物質(zhì)的常用溶劑。水分子的存在可使其它生物分子之間的氫鍵減弱，而與水分子形成氫鍵，水分子還能使溶質(zhì)分子的離子鍵解離，這就是所謂的水合作用。水合作用促使蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子與水形成了水合分子或水合離子從而促使它們?nèi)芙庥谒蛩芤褐?。三、提取效率四、影響提取的因素（一）溫度多?shù)物質(zhì)的溶解度隨提取溫度的升高而增加。另外較高的溫度可以降低物料的粘度，有利于分子擴(kuò)散和機(jī)械攪拌，所以對耐熱成分的提取可以用加熱的方法。對不耐熱的生物活性物質(zhì)的提取，一般在0~10℃進(jìn)行提取。(二)酸堿度多數(shù)生化物質(zhì)在中性條件下較穩(wěn)定，pH值一般應(yīng)控制在4～9范圍內(nèi)，為了增加目的物的溶解度，往往要避免目的物的等電點(diǎn)附近進(jìn)行提取。巧妙地選擇溶劑系統(tǒng)的pH值不但直接影響目的物與雜質(zhì)溶解度，還可以抑制有害酶類的水解破壞作用，防止降解，提高收率。（三）鹽濃度鹽溶作用鹽析作用五、提取方法（一）用酸、堿、鹽水溶液提?。ǘ┍砻婊钚詣┨崛”砻婊钚詣┓肿蛹嬗杏H水與疏水基團(tuán)，分布于油水界面時，有分散、乳化和增溶作用。表面活性劑分陰離子型、陽離子型與非離子型。離子型表面活性劑作用強(qiáng)，但是易引起蛋白質(zhì)等生物大分子的變性，非離子表面活性劑變性作用小，適合于用水、鹽系統(tǒng)無法提取的提取的蛋白質(zhì)或酶的提取。（三）有機(jī)溶劑提取1.固－液提取丙酮從動物腦中提取膽固醇，溶劑分級提取：如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取。石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。丙酮粉2.液－液萃取液－液萃取是利用溶質(zhì)在兩個互不混溶的溶劑中溶解度的差異，將溶質(zhì)從一個溶劑相向另一個溶劑相轉(zhuǎn)移的操作。分配系數(shù)和溶劑用量溶劑萃取的注意事項(xiàng)：（1）pH在萃取操作中正確選擇pH值很重要。因?yàn)樵谒芤褐心承┧?、堿物質(zhì)會解離，在萃取時改變了分配系數(shù)，直接影響提取效率。（2）鹽析加入中性鹽如硫酸銨，氯化鈉等可以使一些生化物質(zhì)的溶解度減少，這種現(xiàn)象成為鹽析。在提取液中加入中性鹽，可以促使生化物質(zhì)轉(zhuǎn)入有機(jī)相從而提高萃取率。（3）溫度一般在室溫下或低溫下進(jìn)行萃取操作。（4）乳化在液液萃取時，常發(fā)生乳化作用，使有機(jī)溶劑與水相分層困難。去乳化的常用方法有：過濾與離心，輕輕攪動，改變兩相的比例；加熱，加電解質(zhì)，加吸附劑。液液萃取時溶劑的選擇：（1）選用的溶劑必須具有較高的選擇性，各種溶質(zhì)在所選的溶劑之間分配系數(shù)差異愈大愈好。（2）選用的溶劑，在萃取后，溶質(zhì)與溶劑要容易分離與回收。(3)兩種溶劑的密度相差不大時容易形成乳化，不利于萃取液的分離。（4）要選用無毒，不易燃燒的價廉易的溶劑。第三節(jié)生物活性物質(zhì)的濃縮與干燥一、生物活性物質(zhì)的濃縮（一）鹽析濃縮硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)（二）有機(jī)溶劑沉淀濃縮在生物大分子的水溶液中，逐漸加入乙醇