廣西野生大豆種質(zhì)資源ssr遺傳多樣性分析

廣西野生大豆種質(zhì)資源ssr遺傳多樣性分析

野生大豆是培育大豆的近緣種植的祖先，是大豆的自然基因庫(kù)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇，它形成了豐富的變異類型，具有抗病、抗旱、抗寒、耐鹽、抗不育、汞柱多、葉厚等有利基因。這是中國(guó)乃至世界上最寶貴的植物遺傳資源。若在種內(nèi)雜交的同時(shí),廣泛利用野生大豆進(jìn)行基因交換,即可擴(kuò)大并豐富栽培大豆種質(zhì)資源。因此,對(duì)野生大豆資源進(jìn)行遺傳多樣性研究,不僅對(duì)保護(hù)中國(guó)珍貴的野生大豆基因資源具有重要意義,同時(shí)對(duì)利用野生大豆材料的優(yōu)異基因改良栽培大豆也具有重大意義。許東河等選用來(lái)自全國(guó)各地的200余份一年生野生大豆材料,從形態(tài)、性狀、等位酶標(biāo)記和細(xì)胞DNARFLP標(biāo)記的遺傳豐富度和遺傳離散度2方面分析中國(guó)野生大豆群體的遺傳多樣性,結(jié)果表明:中國(guó)野生大豆天然群體存在遺傳分化,各地理生態(tài)群體間的遺傳多樣性水平不同,南方群體最高,黃淮海群體次之,東北群體最低,南方為一年生野生大豆的遺傳多樣性中心,也可能是起源中心。董英山等采用群體遺傳學(xué)方法分析了6172份中國(guó)野生大豆資源的數(shù)量、遺傳多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))、12個(gè)性狀的綜合變異系數(shù)及其地理分布,結(jié)果表明:42°N~47°N×122°E~127°E的東北中南部野生大豆資源分布極廣、遺傳多樣性豐富、綜合變異系數(shù)高;34°N~35°N×113°E~115°E、38°N~39°N×113°E~115°E和34°N~35°N×107°E~109°E的黃河中下游和秦嶺山區(qū)野生大豆次之;26°N~27°N×119°E~121°E的東南沿海地區(qū)野生大豆遺傳多樣性、綜合變異系數(shù)均很高,但分布較少。趙洪琨等采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)我國(guó)不同緯度的20份野生大豆(Glycinesoja)和栽培大豆(G.max)進(jìn)行多樣性分析,結(jié)果表明:(1)我國(guó)野生大豆的遺傳多樣性較栽培大豆更為豐富;(2)根據(jù)AFLP分析結(jié)果,將野生大豆和栽培大豆完全劃分為2類,并發(fā)現(xiàn)野生大豆和栽培大豆的種特異譜帶,說(shuō)明野生大豆和栽培大豆作為2個(gè)種是有遺傳基礎(chǔ)的;(3)野生大豆和栽培大豆不同緯度品種間緯度相近的首先聚在一起,表明不同進(jìn)化類型的大豆遺傳距離與緯度可能存在一定的相關(guān)性。趙洪琨等采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)我國(guó)不同緯度的野生大豆和栽培大豆(各22份)進(jìn)行多樣性分析,野生大豆和栽培大豆的平均遺傳距離分別為0.176、0.150,表明野生大豆的多態(tài)性比栽培大豆較為豐富;在遺傳距離0.300處,野生大豆和栽培大豆被明顯分為2類,與以往大豆屬Soja亞屬的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致,為野生大豆和栽培大豆分為2個(gè)種提供了分子水平上的證據(jù)。周曉馥等利用RAPD和SSR技術(shù)對(duì)25°N野生大豆種群16個(gè)樣本進(jìn)行分子標(biāo)記,通過(guò)聚類分析將這16個(gè)樣本分成5類,表明種群內(nèi)存在大量的遺傳變異,為研究野生大豆種群內(nèi)及種群間的遺傳多樣性探索了有效方法,并提出野生大豆核心種質(zhì)資源的保存及取樣對(duì)策。近年來(lái),SSR技術(shù)應(yīng)用較多,在研究中效果很好,而且大豆的SSR技術(shù)也很成熟。但應(yīng)用分子標(biāo)記對(duì)廣西野生大豆進(jìn)行遺傳多樣性的研究還是個(gè)空白,本研究擬利用SSR標(biāo)記從分子水平上對(duì)廣西1980—1981年收集的野生大豆資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,根據(jù)分子標(biāo)記結(jié)果對(duì)野生大豆進(jìn)行聚類分析,建立這些材料間的遺傳關(guān)系圖,對(duì)今后野生大豆的種質(zhì)保存、收集和創(chuàng)新利用等具有十分重要的意義,且為研究廣西栽培大豆起源、進(jìn)化、分類、遺傳,挖掘野生大豆優(yōu)良基因奠定理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1野生大豆資源本研究選取1980—1981年在廣西桂林市全州、興安、灌陽(yáng)、恭城、荔浦、靈川等6個(gè)縣的23個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)收集的68份野生大豆資源(表1),于2009年3月種植野生大豆,待長(zhǎng)出三出復(fù)葉時(shí)取嫩葉片,-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?.2測(cè)試方法1.2.1組織研磨棒研磨取2g左右新鮮葉片放入研缽中,加入PVP和液氮,用組織研磨棒研磨,直至葉片成粉末狀。葉片DNA提取方法參考周恩君的SDS法,在一些具體操作上略有改進(jìn)。1.2.2核心引物篩選謝華等利用中國(guó)秋大豆資源篩選出一套適用于大豆種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的SSR核心引物。為更好地揭示野生大豆的遺傳多樣性,本研究利用10份1980—1981年收集的和12份新收集的廣西野生大豆材料對(duì)這套核心引物進(jìn)行篩選,共篩選出23對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、等位變異較為豐富、適用于廣西野生大豆資源遺傳多樣性研究的SSR引物。SSR引物序列來(lái)自美國(guó)農(nóng)業(yè)部大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(4/SSR.html),SSR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.2.3pcr擴(kuò)增dntpsPCR反應(yīng)在Bio-rad公司的擴(kuò)增儀上進(jìn)行,反應(yīng)體系為15.0μL,其中10×PCR反應(yīng)緩沖液1.36μL、2.0mmol/LMgCl20.8μL、10mmol/LdNTPs0.24μL、5UTaqDNA聚合酶0.1μL、0.2μmol/LSSR引物3.0μL、DNA模板50~100ng,最后加ddH2O至15.0μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min,10℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺非變性凝膠上電泳分離2h(恒定功率40W),銀染檢測(cè)。1.2.4群體平均遺傳多樣性指數(shù)所有材料的SSR位點(diǎn)不同等位變異在銀染過(guò)的聚丙烯酰胺凝膠上都表現(xiàn)為譜帶的“有”和“無(wú)”,將“有”賦值為“1”,“無(wú)”賦值為“0”,建立材料SSR標(biāo)記的0、1矩陣,然后計(jì)算各對(duì)SSR引物的Shannon遺傳多樣性指數(shù)和Simpson遺傳多樣性指數(shù)。Shannon遺傳多樣性指數(shù)Hi=-∑Pij·lbPij;Simpson指數(shù)=1-∑Pij;群體平均遺傳多樣性指數(shù)則為H=∑Hi/n,其中Pij為i位點(diǎn)第j個(gè)等位變異的頻率,n為調(diào)查位點(diǎn)數(shù)。利用NTSYS2.10軟件計(jì)算材料間的Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(D),以非加權(quán)類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析,建立樹(shù)狀聚類圖。2結(jié)果與分析2.1ssr引物多態(tài)性信息提取數(shù)據(jù)的模擬由表2可見(jiàn),23對(duì)SSR引物都表現(xiàn)為多態(tài)性,在68份野生大豆資源中共檢測(cè)到157個(gè)等位基因變異,平均每個(gè)位點(diǎn)6.83個(gè);等位變異數(shù)目范圍為4~11個(gè),其中satt226(位于D2連鎖群)和satt146(位于F連鎖群)最少(4個(gè)),satt462(位于L連鎖群)的最多(11個(gè)),說(shuō)明satt462變異豐富;等位變異數(shù)介于6~11個(gè)的引物有18對(duì),5個(gè)及以下的有5對(duì),不同位點(diǎn)等位變異數(shù)不等。在遺傳多樣性研究中,常用Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來(lái)衡量群體遺傳多樣性大小。根據(jù)SSR標(biāo)記結(jié)果計(jì)算各對(duì)引物Simpson遺傳多樣性指數(shù)和Shannon遺傳多樣性指數(shù),不同的SSR引物多態(tài)性信息量存在一定的差異,Simpson指數(shù)分布范圍為0.539~0.835,平均為0.703,其中satt226(位于D2連鎖群)的最低(0.539),satt243(位于O連鎖群)的最高(0.835);Shannon指數(shù)分布范圍為0.624~0.941,平均為0.714,其中satt226(位于D2連鎖群)的最低(0.624),satt243(位于O連鎖群)的最高(0.835)。從表2可見(jiàn),satt243的Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)均最高,它的等位變異數(shù)為10個(gè);而satt226的Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)最低,它的等位變異數(shù)為4個(gè)。這3個(gè)評(píng)價(jià)遺傳多樣性水平的指標(biāo)具有很大程度的一致性,也就是說(shuō)當(dāng)某一引物的等位變異數(shù)較多時(shí),其Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)也較高。如satt243、satt462、satt577和satt197引物的等位變異數(shù)也較多,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)也較大;satt226、satt146、satt345和satt259引物的等位變異數(shù)也較少,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)也較小。2.2野生大豆材料被聚同圖1可見(jiàn),聚類分析把68份材料分為兩大類,可以有效地將各地區(qū)野生大豆區(qū)分開(kāi),3份收集于興安縣的無(wú)泥膜野生大豆被聚為一類;其他來(lái)自全州、興安、灌陽(yáng)、恭城、荔浦、靈川等6縣的65份有泥膜野生大豆材料被聚為第二類,第二類在相似性系數(shù)為0.77處又聚為3個(gè)亞類。從聚類結(jié)果也可以看出,68份野生大豆在分子水平發(fā)生了一定的遺傳分化,聚類結(jié)果與野生大豆材料生長(zhǎng)的地理環(huán)境、表型性狀等具有一定的相關(guān)性,同一區(qū)域內(nèi)收集到的野生大豆也表現(xiàn)出遺傳分化。3半野生大豆表型性狀的穩(wěn)定性本研究利用23對(duì)SSR引物對(duì)廣西1980—1981年收集的68份野生大豆資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,23個(gè)SSR位點(diǎn)共擴(kuò)增出157條多態(tài)性帶,等位變異數(shù)目范圍為4~11,平均為6.83個(gè);Simpson指數(shù)分布范圍為0.539~0.835,平均為0.703;Shannon指數(shù)分布范圍為0.624~0.941,平均為0.714。根據(jù)分子標(biāo)記結(jié)果對(duì)野生大豆進(jìn)行聚類,68份材料分為兩大類,可以有效地將有泥膜野生大豆與無(wú)泥膜野生大豆材料區(qū)分開(kāi),其中3份無(wú)泥膜野生大豆被聚為一類,其他65份有泥膜野生大豆材料被聚為第二類。結(jié)果表明,野生大豆材料地區(qū)內(nèi)存在著明顯的遺傳分化,野生大豆的遺傳多樣性與地理來(lái)源、野生大豆的表型性狀具有一定相關(guān)性。海林等利用12對(duì)SSR引物對(duì)67份半野生大豆種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析,共檢測(cè)到184個(gè)等位基因變異,平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)目為15.41個(gè)。王果利用33對(duì)SSR引物分析河南省268份野生大豆材料,共檢測(cè)到443個(gè)等位變異,每個(gè)SSR位點(diǎn)的等位變異范圍為6~22個(gè),平均為13.4個(gè),SSR引物Simpson指數(shù)為0.7196;Shannon指數(shù)的平均值為1.7741。王果等利用30對(duì)SSR引物分析了49份山西太原野生大豆材料,共檢測(cè)到208個(gè)等位變異,每個(gè)SSR位點(diǎn)的等位變異范圍為4~11個(gè),平均為7個(gè);引物的Shannon指數(shù)的分布范圍為0.7451~2.1081,平均為1.5030;位點(diǎn)多態(tài)信息量(PIC)值的分布范圍為0.3813~0.8575,平均為0.7007。嚴(yán)茂粉等使用40對(duì)SSR引物分析北京地區(qū)野生大豆天然種群的遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性,10個(gè)種群共檢測(cè)到526個(gè)等位變異,平均每對(duì)引物等位基因數(shù)為13.15個(gè),種群平均Shannon指數(shù)為0.658。王丹等利用27對(duì)SSR引物對(duì)冀東沿海地區(qū)的370份及黑龍江省的2份野生大豆進(jìn)行遺傳多樣性分析,27個(gè)SSR位點(diǎn)擴(kuò)增出209條多態(tài)性帶,平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)目為7.74個(gè),SSR位點(diǎn)Simpson指數(shù)為0.3998~0.8358,Shannon指數(shù)為0.7567~1.9879。本研究的68份材料雖然表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分布范圍雖比嚴(yán)茂粉等的結(jié)果略高,但遺傳變異相