免疫組化操作規(guī)程

免疫組化操作規(guī)程―、實驗原理與意義免疫組織化學(xué)又稱免疫細胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡）的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等）。二、實驗器材微波爐、吹風(fēng)機、組化筆、濕盒、烤箱、振蕩器、染缸、光學(xué)顯微鏡、純木漿衛(wèi)生紙、計時器和通風(fēng)櫥等。三、試劑配制1.0.01MPBS（pH7.34）：9.0gNaCl+50ml0.2MPB加雙蒸水至1000ml；1000ml0.2MPB（pH7.4）=5.93gNaH2PO4?2H2O+58.02gNa2HPO4?12H2Oin1000ml雙蒸水或=190mlA+810mlB（A.0.2MNaH2PO4-2H20:15.6gin500ml71.632gin1000mldH2O）。ddH2O；B.0.2MNa2HPO4-12H71.632gin1000mldH2O）。2.CitrateBufferedSaline（0.01M檸檬酸緩沖液，PH6.0）:28mlA+72mlB+2002.mlddH2O（A.Citrateacid（檸檬酸）：10.5g加雙蒸水至1000ml；B.Citratesodium（檸檬酸鈉）：29.41g加雙蒸水至1000ml）。細胞通透液：由終濃度分別為0.3%雙氧水和0.3%TritonX-100混合而成。配制方法是先用微波加熱的36mlPBS，再接著加120ulTritonX-100，并加熱一會兒，冷卻至臨用前加0.4ml30%H2O2。5%羊血清或封閉血清，用PBS稀釋。含0.03%H2O2的0.05%DAB（避光）：用20XDAB（1%，10mg/ml）5ul+0.1ul30%H2O2+95ulPBS。一抗、二抗均用PBS稀釋。Xylene、梯度Ethanol（100%x2、95%、80%、70%、50%）、雙蒸水、中性樹膠（封裱劑）。蘇木精染液：四、操作步驟1、 脫蠟、水化1） 60°Cx20minfXylene2x10minutes；2） 100%absoluteethanol：2x5minutes；3） 95%ethanol2minutes；4） 80%ethanol2minutes；5） 70%ethanol2minutes；6） distilledwater:5min；7） PBS洗3次x3min。2、 細胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶8） 用封閉通透液浸潤切片30min（RT避光）。配法是用預(yù)熱40mlPBS加120ulTritonX-100加熱幾分鐘后，臨用前加400ul30%.。2。9） PBS溶液洗3次X3min。3、 抗原修復(fù)暴露抗原決定族10） 切片放入0.01M檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4min至沸騰后，再加熱約6minX4次，每次間隔補足液體，防止干片。4、 封閉非特異性蛋白11） PBS溶液洗3次X3min；12） 將切片取出，周圍水分用濾紙吸干，用組化筆在組織周圍畫上圈，在圓圈內(nèi)組織滴入5%羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中，室溫30（10?30）min；5、 一抗孵育13） 甩去切片上的羊血清，用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（1:250、500、1000）后，放入濕盒中室溫1小時，然后4度過夜，從冰箱中取出需37C復(fù)溫45min。6、 二抗孵育14） 將一抗倒掉并用PBS洗5minx5次；15） 用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37C恒溫烤箱中30min（回收）。16） 用PBS洗5次x5min；7、 SP反應(yīng)17） 加入SP后放入37度烤箱中30min。18） 用PBS洗5次x5min；8、 顯色19） 加入DAB（快速滴入，觀察染色情況，倒掉染液），顯色時間控制在約5min（3?10min），由鏡下觀察顏色控制時間。0.05%DAB（避光）（1:20儲備液）：5ul20XDAB+0.1ul30%H2O2+95ulPBS。1%DAB儲備液的配制:50mgDAB+5ml0.05mol/LPBS充分溶解，-20°C保存。9、 復(fù)染、脫水、透明、封片20） 用PBS3次x3min后，用雙蒸水洗5min；21） 加一大滴蘇木素染液，胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染20s后自來水沖洗，雙蒸水洗5min，再用PBS返藍5min。22） 脫水： 50%ethanol1-2min，70%ethanol1-2min< 95%ethanol1-2min；95%ethanol1-2min；100%absoluteethanol:（1-2）min；100%absoluteethanol:（1-2）min。23） 透明：Xylene1x（1-2）min—Xylene2x-1）min24） 封片：中性樹膠。五、注意事項蘇木素復(fù)染時間需要摸索，尤其陽性染色也在細胞核上。DAB顯色時間需要達到最優(yōu)化，鏡下觀察達到陽性染色明顯但背景不太深?？贵w孵育時間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4度過夜。切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩十洗滌液，但又防止干片；用組化筆畫圈時盡量畫大一點，否則墨水排斥液體，引起片周邊十片。片子著色不均勻的原因如下：脫蠟不充分?？梢?0C烤20min，立即放入新鮮的xylene1；水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇；抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑；抗體孵育時，切片放傾斜；抗體孵育后PBS沖洗不充分。制片厚薄不均勻等問題。染片盒不平，切片傾斜。一抗從4°C拿出后，為什么有人說要37度復(fù)溫，目的是什么？一方面，防止切片從4C直接放入PBS易脫片；另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4C和37C度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制；一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；內(nèi)源性過氧化物酶