基因定位與克隆

胡正茂huzhengmao@基因定位與克隆基因定位或基因制圖(genemapping)：人類的基因定位或基因制圖(genemapping)是近年來發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。它的目的在于決定不同的基因在染色體上的位置。一條染色體是一條獨(dú)立的DNA鏈，同一條染色體上的基因在該染色體上呈線性排列。人類的20000-25000個(gè)基因分布在24種染色體上，它們?cè)谌旧w上的位置可通過兩種制圖方法來表示：

1、物理圖譜(physicalmap)，即確定基因之間的絕對(duì)物理學(xué)距離，通常用Mb(百萬堿基對(duì))或Kb(千堿基對(duì))來表示

2、遺傳圖譜(geneticmap)，即確定基因之間的遺傳學(xué)距離，用cM(centimorgen分摩)表示。廣泛定義基因克?。夯蚩寺⊥ǔＩ婕暗綄?gòu)成某一基因的基因組DNA(genomicDNA，gDNA)或互補(bǔ)DNA(complemantaryDNA,cDNA)插入某一載體內(nèi)，利用載體在宿主細(xì)胞(通常用大腸桿菌)中大量繁殖而獲得該基因的足夠量的拷貝，以便于進(jìn)行基因的結(jié)構(gòu)和功能的分析，廣義的基因克隆也包括任何使基因或DNA片段擴(kuò)增的操作

。

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)討論的基因定位與克隆實(shí)質(zhì)上不是廣泛意義上的基因定位與克隆，主要針對(duì)致病基因的鑒定，即將某一特定基因的突變與某一特定的疾病聯(lián)系起來，確定基因突變與某一疾病之間的因果關(guān)系，了解其致病機(jī)理，為疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。基因定位方法

strategyforgenemapping染色體多態(tài)法（chromosomeheteromorphism）染色體畸變法(chromosomeabnormality)體細(xì)胞雜種法(somaticcellhybrids)染色體分類法(chromosomesorting)原位雜交法（FISH）劑量分析法(dosageananlysis)測(cè)序法（sequencing）家系分析法（pedigreeananlysis）染色體多態(tài)法.主要限于性染色體上的定位，根據(jù)某些性狀或疾病在男女性別間的差異，結(jié)合系譜分析，將這些基因定位在X染色體上。Duffy血型基因定位于1號(hào)染色體上(Donahue在做染色體實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)自己的1號(hào)染色體長(zhǎng)臂在靠近著絲粒區(qū)的地方變長(zhǎng)了，通過對(duì)他自己家族成員染色體的觀察發(fā)現(xiàn)，這一異常是遺傳的，將其作為1號(hào)染色體上的一個(gè)特定的標(biāo)記，隨后發(fā)現(xiàn)這一標(biāo)記與Duffy血型具有平行性，表明這種染色體的異常結(jié)構(gòu)同這一基因相連鎖，因此將此血型基因定位于1號(hào)染色體上。)染色體畸變法畸變常涉及兩個(gè)位點(diǎn)，如果這兩個(gè)位點(diǎn)之一正好是某一功能基因所在的位置，染色體的畸變則肯破壞該基因的正常功能而引起疾病，根據(jù)染色體畸變的位置和疾病發(fā)生的關(guān)系，則可將致病基因定位于染色體的某一特定位置上。NLMG染色體異常進(jìn)行基因定位---睪丸決定因子Testisdeterminingfactor體細(xì)胞雜種法

體細(xì)胞雜種通常由人和鼠的體細(xì)胞融合而成。這些融合細(xì)胞在最初幾代培養(yǎng)過程中具有選擇性丟失人類染色體趨勢(shì)，而保留所有的鼠染色體。保留在融合細(xì)胞中的染色體可以是多條，也可能只有一條甚至某條染色體的一部分。根據(jù)研究的需要可將含有不同人類染色體的人鼠雜種細(xì)胞組合成人鼠雜種細(xì)胞板(hybridpanel)，結(jié)合雜種細(xì)胞板和PCR的方法或基因劑量分析，或蛋白質(zhì)表達(dá)分析，可將相應(yīng)的基因定位到特定的染色體或染色體片段上，該雜種細(xì)胞板在人類基因定位以及人類基因組計(jì)劃中發(fā)揮過重要的作用。

體細(xì)胞雜交基因定位示意圖Miller等運(yùn)用體細(xì)胞雜交證明胸苷激酶（TK）位于人的17號(hào)染色體，這是首例應(yīng)用體細(xì)胞雜交法進(jìn)行的基因定位。原位雜交法（FISH）如果一個(gè)基因或基因的某一部分已經(jīng)被克隆，則可將該基因用同位素或熒光標(biāo)記和染色體原位的分子雜交，在染色體上恒定出現(xiàn)信號(hào)的區(qū)域即該基因在染色體上的位置。同一染色體上的多個(gè)不同的基因可用不同的熒光標(biāo)記來鑒別他們?cè)谌旧w上的相對(duì)位置，運(yùn)用這一方法在中期染色體上，可區(qū)分兩個(gè)相隔約2Mb的基因；在間期染色體上，據(jù)稱可鑒別僅相隔50kb的兩個(gè)基因。CONNEXIN31.1候選克隆：根據(jù)基因的功能、結(jié)構(gòu)及已有的研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)可能與目的新基因有關(guān)的疾病，然后在相應(yīng)患者中檢測(cè)該基因的突變情況。位置克?。耗壳白畛Ｓ玫姆椒?，將某一疾病的致病基因用連鎖分析的方法定位在某一染色體的特定位置上或區(qū)域內(nèi)，然后在該位置上或區(qū)域內(nèi)鑒定其致病基因。連鎖分析原理生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生交換，一對(duì)同源染色體上存在著兩兩相鄰的基因座位，若兩者之間距離較遠(yuǎn)，發(fā)生交換的機(jī)會(huì)較多，則出現(xiàn)重組次數(shù)就多；若兩者之間距離較近，則重組機(jī)會(huì)較少。連鎖分析就是根據(jù)基因在染色體上呈線性排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。123基因分型Genotyping

除性染色體外，每個(gè)人體內(nèi)的染色體都有兩份。一個(gè)人所擁有的一對(duì)等位位點(diǎn)的類型被稱作基因型genotype。對(duì)SNP位點(diǎn)而言，一個(gè)人有三種可能性，分別是AA，AG或GG。這種基因型的差異叫做單核苷酸多態(tài)性(SNP)。通過實(shí)驗(yàn)確定某個(gè)個(gè)體在某個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，被稱作基因分型。

幾種多態(tài)標(biāo)記:（1）RFLPs（2）STRPs（3）SNPs

第一代標(biāo)記：

RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）。限制性內(nèi)切酶可在特定的核苷酸位置切割DNA。DNA序列的改變甚至是一個(gè)堿基的改變，都可能改變限制性內(nèi)切酶酶切片段的長(zhǎng)度，通過凝膠電泳可以方便地檢測(cè)這種長(zhǎng)度的“多態(tài)性”。RFLP在整個(gè)基因組中都存在，根據(jù)對(duì)RFLP片段的多態(tài)性分析，可對(duì)某些疾病進(jìn)行診斷并將與疾病有關(guān)的基因進(jìn)行定位?！?projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml1980年，Botstein首次提出。使用特殊的外切酶切斷DNA中特殊位點(diǎn)1987年，第一張較完整的人基因連鎖圖,包含393個(gè)RFLP位點(diǎn)。缺點(diǎn)：數(shù)目少，信息量?。怀杀景嘿F，操作繁瑣，不易發(fā)展到自動(dòng)化水平。

第二代標(biāo)記:STR(shorttandemrepeatpolymorphism)。例如基因組中兩個(gè)或兩個(gè)以上的核苷酸短串聯(lián)重復(fù)序列(CA)n，微衛(wèi)星標(biāo)記等，在不同個(gè)體中重復(fù)單位的數(shù)目變異非常大。微衛(wèi)星標(biāo)記熒光電泳圖STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是2bp-6bp的串聯(lián)重復(fù)，其中以(CA)n，(GT)n常見。1996年建立了以6000多個(gè)STR為主體的遺傳圖譜，目前有10000個(gè)左右的位點(diǎn)。主要用于個(gè)體識(shí)別優(yōu)點(diǎn)：信息量大；易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。缺點(diǎn)：標(biāo)記數(shù)量不夠多隨著人類基因組計(jì)劃、國際人類基因組單體型計(jì)劃（Hapmap計(jì)劃）的完成，大量的SNP被發(fā)現(xiàn)。利用先進(jìn)的高通量基因芯片技術(shù)，精確揭示重大疾病的基因變異，從而闡明疾病的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制，是目前科學(xué)界公認(rèn)的最為有效的搜尋重大疾病易感基因的研究方法，被Science雜志評(píng)為2007年十大科學(xué)進(jìn)展之首。迄今已發(fā)現(xiàn)的SNP約900～1,000萬個(gè)，相關(guān)的文章約4000余篇。特點(diǎn)：數(shù)量豐富雙等位標(biāo)記，簡(jiǎn)單的+/-分析根據(jù)結(jié)果可以估算出某個(gè)等位基因在一個(gè)群體中的頻率易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，快速篩查SNP作為遺傳標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)家系分析法（Lods）在家系中，重組率是進(jìn)行連鎖分析的基礎(chǔ)L(Θ)=Θr(1-Θ)n-r=Θ1(1-Θ)4Lods=lg【(0.2*0.84)/0.55】=0.4185Lods=0.1249L(Θ)=Θr(1-Θ)n-r=Θ1(1-Θ)4/2+Θ4(1-Θ)/2Lodscore結(jié)果判定：

Lod>3肯定連鎖，Lod<-2否定連鎖，

-2<Lod<1則還需增加樣本資料。2010年在國內(nèi)最早應(yīng)用外顯子組測(cè)序技術(shù)克隆了一個(gè)新的共濟(jì)失調(diào)致病基因TGM62004年

定位與克隆角膜環(huán)狀皮樣瘤基因

角膜環(huán)狀皮樣瘤是一種先天性角膜良性腫瘤，呈常染色體顯性遺傳，以雙側(cè)眼球角膜緣處環(huán)形淡黃色腫塊為特征，可延伸到結(jié)膜，患者可出現(xiàn)視力的改變?nèi)缛跻暋⑿币暫蜕⒐?。皮樣瘤由外胚層包括角化的上皮、毛發(fā)、皮脂腺和中胚層包括纖維組織、脂肪組織、血管組成角膜環(huán)狀皮樣瘤家系圖

基因組掃描的流程DNA抽提利用STR引物多重PCRGenotype基因分型Linkage連鎖分析侯選基因，突變檢測(cè)定位基因多重PCR使用PE公司一套覆蓋基因組22條常染色體、高雜合度的微衛(wèi)星位點(diǎn)引物，一共382對(duì)。采用Touchdown程序結(jié)合多重PCR反應(yīng)方法，將5～12種不同引物混合,放入同一管中進(jìn)行擴(kuò)增，總反應(yīng)體積5μl

以上結(jié)果說明這個(gè)單體型在該家系中與疾病共分離，而這些重組事件的發(fā)生則將角膜環(huán)狀皮樣瘤疾病基因定位于4q24-26的D4S1572和D4S1522之間15.2cM范圍內(nèi)侯選基因的篩選首先進(jìn)行UCSC數(shù)據(jù)庫（April,2003）查詢D4S1572-D4S1522之間15.2cM的基因資料，結(jié)果顯示在這個(gè)區(qū)間總計(jì)有65個(gè)knowngenes,52個(gè)Referencegenes進(jìn)行候選基因篩選時(shí)，考慮到組織發(fā)生中皮樣瘤為異位到角膜的正常組織，推測(cè)角膜環(huán)狀皮樣瘤致病基因可能與胚層的移行、細(xì)胞的發(fā)育和分化密切相關(guān)侯選基因的篩選通過篩選，選取其中3個(gè)能與組織細(xì)胞的發(fā)育分化和移行有關(guān)并在眼睛表達(dá)的基因：

CXXC4PITX2TM4SF9PITX2——是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與發(fā)育相關(guān)，有重要的功能神經(jīng)性耳聾疾病基因GJB3的克隆GJB3基因的計(jì)算機(jī)克隆3’RACE或者nested-PCR共獲得cDNA片段1059bp，其中ORF813bp，編碼的氨基酸270aa個(gè)。該ORF與小鼠Gjb3在813bp的一致性為83.4%，與大鼠Gjb3在813bp的一致性為84.6%。推測(cè)的氨基酸與小鼠Gjb3在270aa的一致性為82.6%，與大鼠Gjb3在270aa的一致性為83%。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu):4個(gè)跨膜區(qū)

2個(gè)胞外區(qū)

3個(gè)胞內(nèi)區(qū)1of5Humancx31compareto