一般毒性作用試驗(yàn)

一般毒性作用試驗(yàn)10/7/202313R原則：ReplacementReductionRefinementRpentlecameRnifoitcudRtnemen填詞游戲10/7/20232一般毒性毒性

§1急性毒性作用

§2蓄積毒性

§3亞慢性和慢性毒性作用

§4局部毒性作用10/7/20233§1急性毒性作用一、急性毒性和急性毒性試驗(yàn)的目的二、急性毒性試驗(yàn)三、急性毒性分級(jí)10/7/20234一、急性毒性和急性毒性試驗(yàn)的目的急性毒性(acutetoxicity)是指機(jī)體(人或試驗(yàn)動(dòng)物)一次接觸或24小時(shí)內(nèi)多次接觸化學(xué)物后在短期(最長(zhǎng)到14天)內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)。急性毒性作用10/7/20235一、急性毒性和急性毒性試驗(yàn)的目的目的①測(cè)試和求出化學(xué)毒物對(duì)一種或幾種試驗(yàn)動(dòng)物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性參數(shù)，了解急性毒作用強(qiáng)度。②并通過(guò)觀察動(dòng)物中毒表現(xiàn)和死亡的情況，了解急性毒作用性質(zhì)、可能的靶器官和致死原因，提供化學(xué)毒物的急性中毒資料、初步評(píng)價(jià)對(duì)人體產(chǎn)生損害的危險(xiǎn)性。③探求化學(xué)毒物急性毒性的劑量—反應(yīng)關(guān)系與中毒特征。④為亞慢性、慢性毒性作用試驗(yàn)的染毒劑量設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)。⑤研究化學(xué)毒物急性中毒的預(yù)防和急救治療措施。⑥為毒理學(xué)機(jī)制研究提供線索

。10/7/20236一、急性毒性和急性毒性試驗(yàn)的目的急性毒性試驗(yàn)常用的毒性參數(shù)：LD50/LC50Zac（LD50/Limac）Zac為半數(shù)致死劑量與急性閾劑量的比值LD84/LD16(或LC84／LC16)

劑量—反應(yīng)曲線斜率

急性毒性作用10/7/20237二、急性毒性試驗(yàn)的主要步驟健康動(dòng)物的選擇性別辨認(rèn)動(dòng)物稱重、編號(hào)和分組劑量設(shè)置受試物的配制灌胃中毒體征和動(dòng)物死亡情況觀察LD50的計(jì)算10/7/20238二、急性毒性試驗(yàn)(一)試驗(yàn)動(dòng)物[原則]：①急性毒性試驗(yàn)要求選擇對(duì)化學(xué)毒物的代謝和毒效應(yīng)表現(xiàn)與人的反應(yīng)盡可能一致的試驗(yàn)動(dòng)物。-相似性原則②動(dòng)物易于獲得-可獲得性原則③品系純化-重復(fù)性和均一性原則④價(jià)格較低和易于飼養(yǎng)等條件。-相容或相匹配原則10/7/20239二、急性毒性試驗(yàn)1．試驗(yàn)動(dòng)物的種屬和品系最好用兩種種屬的動(dòng)物嚙齒類:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非嚙齒類：狗或猴。急性皮膚毒性試驗(yàn)可選用成年大鼠、豚鼠或家兔，優(yōu)先考慮白色家兔。而急性吸入毒性試驗(yàn)和經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)則優(yōu)先考慮大鼠。急性毒性作用10/7/202310二、急性毒性試驗(yàn)⒉試驗(yàn)動(dòng)物的年齡和體重：急性試驗(yàn)動(dòng)物不宜過(guò)老或過(guò)幼，通常要求選擇剛成年動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，而且須是未曾交配和受孕的動(dòng)物。例如：大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～15kg。同一批試驗(yàn)動(dòng)物體重變異范圍不應(yīng)超過(guò)該批動(dòng)物平均體重的20％。

急性毒性作用10/7/202311三、急性毒性試驗(yàn)3.試驗(yàn)動(dòng)物的性別：急性毒性試驗(yàn)的主要內(nèi)容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性試驗(yàn)對(duì)動(dòng)物性別要求為雌雄各半。如果在預(yù)試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)化學(xué)毒物(如農(nóng)藥)對(duì)雌、雄動(dòng)物毒效應(yīng)的敏感性有明顯差異，則應(yīng)單獨(dú)分別求出雌性與雄性動(dòng)物各自的LD50。如果試驗(yàn)是為致畸試驗(yàn)作準(zhǔn)備，也可僅作雌性動(dòng)物的LD50測(cè)試。

急性毒性作用10/7/202312二、急性毒性試驗(yàn)4.動(dòng)物數(shù)量與隨機(jī)分組：大、小鼠等小動(dòng)物每組10只狗等大動(dòng)物每組6只分組原則——隨機(jī)化原則5.禁食：經(jīng)消化道染毒時(shí)，要求試驗(yàn)前對(duì)動(dòng)物禁食大鼠、小鼠——隔夜進(jìn)食；染毒后禁食4h大動(dòng)物——每日上午喂食前染毒染毒后繼續(xù)禁食2~4h，但在禁食時(shí)要保障飲水。6.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的預(yù)檢：選擇健康動(dòng)物1~2周的檢疫期急性毒性作用10/7/202313二、急性毒性試驗(yàn)（二）試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境恒定的溫度：22±3℃濕度：30~70%照度：晝夜各半飼料合格、飲水合格、墊料合格急性毒性作用10/7/202314二、急性毒性試驗(yàn)（三）染毒途徑的選擇:

染毒途徑（exposureroutes）的選擇需考慮：1、模擬人在生活和生產(chǎn)環(huán)境中實(shí)際接觸受試物的途徑和方式；2、有利于不同化學(xué)物之間急性毒性大小的比較；3、受試物的性質(zhì)和用途；4、各種受試物毒性評(píng)價(jià)程序的要求等。

最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。

急性毒性作用10/7/202315二、急性毒性試驗(yàn)經(jīng)口(胃腸道)接觸:

灌胃:小鼠0.2

1.0ml/只或0.1

0.5ml/10g大鼠一次灌胃體積不超過(guò)5ml/只家兔不超過(guò)10ml/2kg狗不超過(guò)50ml/10kg

吞咽膠囊:

經(jīng)呼吸道接觸:

靜式吸入動(dòng)式吸入

經(jīng)皮膚接觸:注射途徑接觸:

急性毒性作用10/7/202316二、急性毒性試驗(yàn)（四）染毒劑量與分組:

1．查閱文獻(xiàn)①了解化學(xué)毒物的結(jié)構(gòu)式、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)、熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、密度、閃點(diǎn)、揮發(fā)度、蒸氣壓、水溶性和脂溶性等理化特性，生產(chǎn)批號(hào)及純度，雜質(zhì)成分與含量等。②確定使用哪一種計(jì)算方法求LD50，然后再設(shè)計(jì)劑量分組。LD50的計(jì)算方法常用寇氏法、概率單位法、霍思法等。③找出與受試化學(xué)毒物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學(xué)物的毒性資料，并以文獻(xiàn)資料中相同的動(dòng)物種系和相同接觸途徑所測(cè)得的LD50(LC50)值作為受試化學(xué)物的預(yù)期毒性中值。急性毒性作用10/7/202317二、急性毒性試驗(yàn)（四）染毒劑量與分組:2．預(yù)試驗(yàn)

①設(shè)定以此預(yù)期值作為待測(cè)化學(xué)物的中間劑量組，并在該劑量的上下各設(shè)計(jì)l一2個(gè)劑量組作為預(yù)試驗(yàn)劑量。②根據(jù)確定的劑量組進(jìn)行染毒。③根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的死亡資料確定組距。

10/7/202318二、急性毒性試驗(yàn)（四）染毒劑量與分組:3．正式試驗(yàn);

一般來(lái)說(shuō)、根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)所選用的LD50計(jì)算方法來(lái)確定組數(shù)。

急性毒性作用10/7/202319二、急性毒性試驗(yàn)（五）試驗(yàn)周期與毒效應(yīng)觀察1.中毒癥狀10/7/202320二、急性毒性試驗(yàn)（五）試驗(yàn)周期與毒效應(yīng)觀察:

2.體重在觀察試驗(yàn)動(dòng)物中毒癥狀的過(guò)程中，應(yīng)同時(shí)觀察體重的變化。體重可以反映動(dòng)物中毒后的整體變化。體重改變的原因很多，若化學(xué)毒物刺激或損傷消化道可出現(xiàn)試驗(yàn)動(dòng)物飲食減少甚至拒食，表現(xiàn)為體重減輕。若化學(xué)毒物引起腹瀉，將影響食物吸收和利用，體重也會(huì)減輕。如果化學(xué)毒物影響水的攝取或腎功能急性損傷，也可能在體重上反映出來(lái)。所以，對(duì)存活動(dòng)物尤其是對(duì)低于LD50劑量組的存活動(dòng)物．應(yīng)在觀察期14天內(nèi)稱量其體重的變化．以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。急性毒性作用10/7/202321二、急性毒性試驗(yàn)（五）試驗(yàn)周期與毒效應(yīng)觀察:3.病理檢查及其他指標(biāo):急性毒性試驗(yàn)中，對(duì)死亡的動(dòng)物均應(yīng)及時(shí)進(jìn)行大體解剖和病理組織學(xué)檢查，肉眼觀察主要臟器的大體病理變化，如臟器大小、外觀、色澤的變化，有無(wú)充血、出血、水腫或其它改變，對(duì)有改變的臟器進(jìn)行取材做組織病理學(xué)檢查。對(duì)存活動(dòng)物在觀察期結(jié)束時(shí)進(jìn)行大體病理檢查．必要時(shí)做組織病理學(xué)檢查。根據(jù)試驗(yàn)需要可進(jìn)一步擴(kuò)大觀察項(xiàng)目．如體溫、心電圖、腦電圖或進(jìn)行某些生化指標(biāo)測(cè)定等。急性毒性作用10/7/202322二、急性毒性試驗(yàn)（五）試驗(yàn)周期與毒效應(yīng)觀察4.死亡和死亡時(shí)間重點(diǎn)觀察和記錄每只動(dòng)物死亡的時(shí)間，特別是最早出現(xiàn)死亡的時(shí)間以及各個(gè)劑量組動(dòng)物的死亡數(shù)。分析中毒死亡時(shí)間的規(guī)律具有一定意義，可為深人研究化學(xué)物的毒作用機(jī)制提供參考。

急性毒性作用10/7/202323LD50的計(jì)算方法改進(jìn)寇氏法霍恩法序貫法Bliss法10/7/202324改進(jìn)寇氏法是利用計(jì)量對(duì)數(shù)與死亡率呈S型曲線而設(shè)計(jì)的方法，又稱平均致死量法。本法要求每個(gè)染毒劑量組動(dòng)物數(shù)要相同，各劑量組組距呈等比級(jí)數(shù)，死亡率呈正態(tài)分布，最低劑量組死亡率<20%，最高劑量組>80%。10/7/202325計(jì)算公式如下：M=Xk-i(∑p-0.5)Sm=i(∑pq/n)1/2M:lgLD50i：相鄰兩劑量組之對(duì)數(shù)差值Xk：最大劑量的對(duì)數(shù)值；q：存活率∑p：各組死亡率之和;n:每組動(dòng)物數(shù)10/7/202326組別劑量對(duì)數(shù)動(dòng)物數(shù)死亡數(shù)

1.17611001.25611021.33611051.41611071.496110910/7/202327M=Xk-i(∑p-0.5)=1.4961-0.08（2.3-0.5）Sm=i(∑pq/n)1/2=0.08（0.16/10+0.25/10+0.21/10+0.09/10）1/210/7/202328霍恩法利用劑量對(duì)數(shù)與死亡率的轉(zhuǎn)換數(shù)呈直線關(guān)系而設(shè)計(jì)的方法，又稱平均移動(dòng)法或劑量遞增法。該法使用動(dòng)物數(shù)少，可直接查表求出LD50。該法推薦使用4個(gè)染毒劑量，要求每組動(dòng)物數(shù)相等，一般用4-5只動(dòng)物，且劑量組按等比級(jí)數(shù)排列。10/7/202329序貫法又稱平均數(shù)法、階梯法或上-下法，先以一個(gè)劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，若動(dòng)物死亡，則以下一個(gè)較小劑量試探；若動(dòng)物存活，則以較大劑量試探，依次類推，最終求出LD50。10/7/202330LD50=(∑xf)/nn:使用的動(dòng)物總數(shù)；X：每個(gè)劑量組的劑量f:每個(gè)劑量組使用動(dòng)物數(shù)10/7/202331舉例：小鼠經(jīng)口給與某化學(xué)物染毒，10mg/kg劑量試探，預(yù)計(jì)使用4個(gè)劑量組，劑量組距對(duì)數(shù)值0.2，設(shè)計(jì)使用12只動(dòng)物，結(jié)果如下劑量存活死亡12.590210.00237.94226.311010/7/202332∑xf=12.59×2+10×5+7.94×4+6.31×1該法優(yōu)點(diǎn)是節(jié)省動(dòng)物，一般12-14只左右動(dòng)物即可完成實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)？10/7/202333二、急性毒性試驗(yàn)(六)經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)的局限性1.消耗的動(dòng)物量大2.獲得的信息有限3.測(cè)得的LD50僅僅是一個(gè)近似值4.在安全性評(píng)價(jià)中僅評(píng)價(jià)動(dòng)物死亡和簡(jiǎn)單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學(xué)、血液學(xué)及其它化驗(yàn)檢查所提供的深入細(xì)致的毒性信息。急性毒性作用10/7/202334三、急性毒性評(píng)價(jià)外源化學(xué)物急性毒性分級(jí)（WHO）毒性分級(jí)大鼠一次經(jīng)口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小時(shí)，死亡2~4只的濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50(/mg/kg)對(duì)人可能致死的估計(jì)量g/kg總量(g/60kg)劇毒<1<10<5<0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250實(shí)際無(wú)毒5000~10000~2180~>15>1000急性毒性作用10/7/202335三、急性毒性評(píng)價(jià)我國(guó)食品毒理急性毒性分級(jí)法(1994)急性毒性分級(jí)大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg)大致相當(dāng)于70kg人的致死量6級(jí)(極毒)<1稍嘗,<7滴5級(jí)(劇毒)1~507滴~1茶匙4級(jí)(中等毒)51~5001茶匙~35克3級(jí)(低毒)501~500035~350克2級(jí)(實(shí)際無(wú)毒)5001~15000350~1050克1級(jí)(無(wú)毒)>15000>1050克急性毒性作用10/7/202336一、基本概念二、

蓄積毒性試驗(yàn)方法及其評(píng)價(jià)蓄積作用及其評(píng)價(jià)§2蓄積毒性10/7/202337

化學(xué)毒物進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)過(guò)生物轉(zhuǎn)化以代謝產(chǎn)物或化學(xué)物原型排出體外。但是，當(dāng)化學(xué)毒物反復(fù)多次給動(dòng)物染毒，化學(xué)毒物進(jìn)入機(jī)體的速度(或總量)超過(guò)代謝轉(zhuǎn)化的速度和排泄的速度(或總量)時(shí)，化學(xué)毒物或其代謝產(chǎn)物就有可能在機(jī)體內(nèi)逐漸增加并貯留，這種現(xiàn)象稱為化學(xué)毒物的蓄積作用(accumulation)。

一、基本概念10/7/202338某些毒物多次以小劑量反復(fù)進(jìn)入體內(nèi)，可表現(xiàn)出機(jī)體對(duì)該毒物的反應(yīng)性增強(qiáng)，即一次染毒不引起反應(yīng)的劑量，如多次重復(fù)染毒，則可能引起明顯的反應(yīng)甚至死亡。毒物的蓄積與進(jìn)入機(jī)體的毒物劑量、重復(fù)染毒的間隔時(shí)間、毒性及代謝特點(diǎn)和機(jī)體反應(yīng)特性條件有關(guān)。10/7/202339

蓄積作用實(shí)際上有二個(gè)含義：

物質(zhì)蓄積(materialaccumulation)

功能蓄積(functionalaccumulation)蓄積作用及其評(píng)價(jià)一、基本概念10/7/202340物質(zhì)蓄積：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)多次接觸化學(xué)物后，用化學(xué)分析方法能夠檢測(cè)到機(jī)體內(nèi)存在該化學(xué)物或代謝產(chǎn)物功能（機(jī)能）蓄積：有的化學(xué)物在長(zhǎng)期接觸后，機(jī)體內(nèi)雖不能檢測(cè)到機(jī)體內(nèi)存在該化學(xué)物或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用。10/7/202341功能蓄積可能是由于機(jī)體內(nèi)的化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，不能檢測(cè)出物質(zhì)的蓄積或者是由于每次機(jī)體接觸化學(xué)物后所引起的損害累積所致10/7/202342蓄積作用的檢測(cè)方法應(yīng)用化學(xué)分析或其他技術(shù)測(cè)定化學(xué)物進(jìn)入機(jī)體后在體內(nèi)含量的變化過(guò)程。該方法可確定化學(xué)的半衰期生物學(xué)方法：即將一次染毒與多次染毒所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行比較，故該法所檢測(cè)的蓄積性不能區(qū)分功能蓄積和物質(zhì)蓄積。10/7/202343二、蓄積毒性試驗(yàn)方法及其評(píng)價(jià)化學(xué)毒物的蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此研究化學(xué)毒物在機(jī)體內(nèi)的蓄積性是評(píng)價(jià)化學(xué)毒物能否引起潛在慢性毒性的依據(jù)之一，也是衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制訂過(guò)程選擇安全系數(shù)的主要依據(jù)。蓄積毒性試驗(yàn)是研究化學(xué)毒物基礎(chǔ)毒性的重要內(nèi)容之一，目的是通過(guò)試驗(yàn)求出蓄積系數(shù)K，了解化學(xué)毒物蓄積毒性的強(qiáng)弱，并為慢性毒性試驗(yàn)及其他有關(guān)毒性試驗(yàn)的劑量選擇提供參考。10/7/202344(一)蓄積系數(shù)法

蓄積系數(shù)(accumulationcoefficient)是多次染毒使半數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)效應(yīng)(或死亡)的累積劑量[ED50(n)]與一次染毒使半數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)相同效應(yīng)(或死亡)的劑量[ED50(1)]的比值，即：K＝ED50(n)/ED50(1)K＝LD50(n)/LD50(1)蓄積作用及其評(píng)價(jià)二、蓄積毒性試驗(yàn)方法及其評(píng)價(jià)10/7/202345(2)蓄積系數(shù)法常用試驗(yàn)方案

①固定劑量法②劑量遞增法③劑量固定的20天蓄積法10/7/202346①固定劑量法動(dòng)物：常用大鼠或小鼠分2組：染毒組和對(duì)照組每組至少20只，雌雄各半。固定劑量：1/20～1/5LD50

每日固定劑量、定時(shí)和相同途徑染毒終止時(shí)間：試驗(yàn)組累計(jì)發(fā)生一半動(dòng)物死亡。如接觸劑量已累計(jì)達(dá)5個(gè)LD50，也可終止。實(shí)驗(yàn)期限：最短為25天，最長(zhǎng)100天。10/7/202347②劑量遞增法動(dòng)物：常用大或小鼠40只（或更多）分組：染毒組和對(duì)照組每組至少20只，雌雄各半。終止時(shí)間：試驗(yàn)組累計(jì)發(fā)生一半動(dòng)物死亡。在第21天也可結(jié)束，因累計(jì)劑量已達(dá)5.26LD50。試驗(yàn)最長(zhǎng)為28天。10/7/2023480.400.600.901.362.003.004.48每日接觸劑量（LD50）接觸天數(shù)四日接觸總劑量（LD50）累積接觸總劑量（LD50）14589121316172021242528

0.100.150.220.340.500.751.12

劑量遞增法使用劑量表0.401.001.903.265.268.2612.74

10/7/202349分組劑量

1/20LD501/10LD501/5LD501/2LD50對(duì)照組染毒1次/d×20dn

10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）③劑量固定的20天蓄積法10/7/202350分組劑量1/20LD501/10LD501/5LD501/2LD50對(duì)照組n10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）死亡╳╳╳╳╳蓄積性不明顯死