雙向電泳原理與工作流程-洪永聰-07.12.24

雙向電泳的基本原理

與工作流程洪永聰青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院微生物學教研室主要內(nèi)容一、蛋白質(zhì)組學的概念二、雙向電泳的基本原理三、雙向電泳的工作流程雙向電泳的基本原理與工作流程一、蛋白質(zhì)組學的概念主要包括基因定位和全序列測序：2002年宣布完成人類基因組計劃Dulbecco于1986年提出1990年由美國能源部和國立衛(wèi)生院啟動雙向電泳的基本原理與工作流程

GENOMICS基因（gene）：是有功能的DNA片段，是遺傳的結(jié)構(gòu)和功能單位染色體（chromosome）：是DNA的主要存在形式基因組（genome,gene+chromosome）：一個細胞內(nèi)所有DNA分子的總和；基因組學（genomics）即是研究基因組結(jié)構(gòu)和功能的科學雙向電泳的基本原理與工作流程生物學名基因組大?。╞p）基因數(shù)λ噬菌體λphage5×10450T4噬菌體T4phage2×105150大腸桿菌Escherichiacoli4.7×1064100枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis4.2×1064700啤酒酵母Saccharomycescerevisiae13.5×1065800脈孢菌Neurosporasp.6.0×1076000果蠅Drosophilamelanogaster

8×107

12000人human3×10950000雙向電泳的基本原理與工作流程WhatHurdlesGenomics?DNAProtein-DNA何時被翻譯？豐度如何？-基因剔除或過表達的影響如何？-蛋白折疊、后修飾、定位？-etc..ProteinProtein雙向電泳的基本原理與工作流程RelationalQueryToolsSequencedatabasesGenomeWhatcouldhappenGeneExpressiondatabasesTranscriptome+WhatwouldhappenProteinExpressiondatabasesProteome+WhatishappeningFromGenestoProteins雙向電泳的基本原理與工作流程PROTEOME1994M.WilkinsandK.W.Williams:MacquarieUniversityinSydneyProtein＋ome＝Proteome:即基因所能表達的全部蛋白質(zhì)，更為清楚的表達是細胞或組織或機體在特定時間和空間上表達的所有蛋白質(zhì)雙向電泳的基本原理與工作流程OneGenome–ManyProteomes雙向電泳的基本原理與工作流程ProteomicsDefinitionExpressionProteomicsFunctionalProteomicsStructuralProteomics雙向電泳的基本原理與工作流程蛋白質(zhì)組研究的主要方向基于基因組和cDNA文庫的組成蛋白質(zhì)組或功能蛋白質(zhì)組研究重大疾病的蛋白質(zhì)組研究：臨床診斷、病理研究、藥物篩選開發(fā)等技術(shù)平臺的建立（包括生物信息學）雙向電泳的基本原理與工作流程組成蛋白質(zhì)組(expressionalproteome)功能蛋白質(zhì)組(functionalproteome)側(cè)重于研究一個細胞或組織中所有蛋白質(zhì)的表達狀況，包括表達參考圖譜的構(gòu)建、蛋白質(zhì)鑒定與數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、蛋白質(zhì)翻譯后修飾和蛋白復合物結(jié)構(gòu)的測定、以及不同生理或病理條件下蛋白質(zhì)的比較分析等主要研究蛋白質(zhì)的細胞定位、蛋白酶的活性、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的連鎖關(guān)系及其由此實現(xiàn)的信號傳遞與調(diào)控作用雙向電泳的基本原理與工作流程蛋白質(zhì)組研究的復雜性20種化學和物理性質(zhì)不同的氨基酸蛋白質(zhì)量的動態(tài)差別（106）蛋白質(zhì)不能擴增蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)修飾的多樣性和復雜性雙向電泳的基本原理與工作流程

蛋白質(zhì)組學的主要研究方法基于雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)和液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組研究：MALDI－MS(matrix-assistedlaserdesorptionionization)和ESI－MS(electrosprayionization)基于同位素標簽的蛋白質(zhì)組研究基于蛋白質(zhì)芯片的蛋白質(zhì)組研究雙向電泳的基本原理與工作流程雙向電泳的基本原理與工作流程ImageAnalysisandSpotExcisionAutomatedMALDI-MSdatabasesearch雙向電泳的基本原理與工作流程ARoadMaptoDiscovery雙向電泳的基本原理與工作流程ProteinIdentificationMappingA‘map’isaguidetogeographicalorientationamongstacomplexseriesofstreetsandplacesWhatifthestreetsandplaceshadnonames?A‘map’isaguidetogeneexpressionamongstmanychemicallyuniqueproteinsInvalidwithoutproteinidentification雙向電泳的基本原理與工作流程雙向電泳的基本原理與工作流程MALDI-MSPeptideFingerprint雙向電泳的基本原理與工作流程二、雙向電泳的基本原理雙向電泳的基本原理與工作流程MonomersAcrylamidobuffersorImmobilines(10%)弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物

MatrixMonomers(90%)PolymerizationgroupBufferinggroupAcrylamideBis雙向電泳的基本原理與工作流程AcrylamidoBuffersorImmobilinesAcidic

Basic雙向電泳的基本原理與工作流程+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10The1stD:IsoelectricFocusing雙向電泳的基本原理與工作流程雙向電泳的基本原理與工作流程+–pH3pH7.5pH10–pH3pH7.5pH10chargesizeThe2ndD:SDS雙向電泳的基本原理與工作流程pIM.Wt.雙向電泳的基本原理與工作流程三、雙向電泳的工作流程Gelstaining1stdimensionIEF2nddimensionSDSImagingandAnalysisSpotexcisionSamplePreparation雙向電泳的基本原理與工作流程SamplePreparation樣品準備的基本原則盡可能讓目的蛋白溶解，蛋白樣品需在檢測范圍避免蛋白樣品沉淀、凝聚、被酶解或化學降解去除干擾的雜質(zhì)（鹽類，離子型表面活性劑如SDS，核酸，脂類，糖類）去除干擾蛋白和高豐度蛋白雙向電泳的基本原理與工作流程增加樣品溶解性的手段變性劑——尿素和硫尿：使樣品蛋白變性，并使酶失活表面活性劑——TritonX-100和CHAPS：使樣品蛋白充分溶解還原劑——DTT和TBP：使蛋白處于還原狀態(tài)，并提高溶解度兩性電解質(zhì)：起載體作用雙向電泳的基本原理與工作流程常用的樣品制備液ReagentAmount8Murea24g50mMDTT500

lof200mMstock4%CHAPS2g0.2%carrierampholytes250lof40%stock0.0002%bromophenolblue100

lof0.1%stockddH2OTo50ml雙向電泳的基本原理與工作流程雙向電泳常見問題雙向電泳的基本原理與工作流程1stdimensionIEF蛋白定量雙向電泳的基本原理與工作流程SecondDimensionSDSMultipleGelFormatsMiniCriterionPROTEAN1°:60gsample,20kV-hr2°:8.6x6.8cm,40min944spots1°:100gsample,50kV-hr2°:13.3x8.7cm,1hr1,287spots1°:150gsample,80kV-hr2°:18.3x19.3cm,5.5hr1,724spots雙向電泳的基本原理與工作流程水化上樣雙向電泳的基本原理與工作流程