實(shí)驗(yàn)2-UU任一目的基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)鑒定20160426

UU任一目的基因原核表達(dá)載體構(gòu)建

及表達(dá)鑒定

設(shè)計(jì)性、創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)

綜合實(shí)驗(yàn)室1內(nèi)容提示1.實(shí)驗(yàn)基本原理2.試劑及儀器準(zhǔn)備3.操作步驟4.注意事項(xiàng)5.實(shí)驗(yàn)意義2一、實(shí)驗(yàn)原理DNA克隆又稱基因克隆或分子克隆。廣義的分子克隆主要包括上游技術(shù)（重組DNA技術(shù)）和下游技術(shù)（基因表達(dá)技術(shù)）。而狹義的分子克隆僅指重組DNA技術(shù)。3基因重組：利用酶學(xué)方法將不同來源的DNA分子組裝成一個(gè)新的重組DNA分子。重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段4總體技術(shù)路線

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞）篩（選陽性克隆）

表（達(dá)目的基因）5

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線67

解脲脲原體(

Ureaplasmaurealyticum,UU)亦稱溶脲脲原體，是六種脲原體屬中的一種，與人類泌尿生殖道感染有密切關(guān)系。在分類上屬支原體科脲原體屬。解脲脲原體是人類泌尿生殖道常見的寄生菌之一，在特定環(huán)境下可致病。近年來，解脲脲原體所致泌尿生殖道感染日益受到重視，是引起非淋菌性尿道炎的病原體之一?，F(xiàn)已被列為性傳播疾病的病原體。目前，尚無可行的疫苗供人類使用。本研究為篩選潛在的UU疫苗候選基因奠定基礎(chǔ)。二、試劑及儀器準(zhǔn)備1．引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增試劑，注意選用高保真酶2．酶切載體和目的基因試劑限制性核酸內(nèi)切酶BamH

Ⅰ和Not

Ⅰ，購至試劑公司，試劑公司附送相應(yīng)的10×限制性核酸內(nèi)切酶緩沖液3．載體和目的基因片段回收、純化試劑DNA片段膠回收試劑盒，購至試劑公司，其組成為：吸附柱、收集管、結(jié)合緩沖液（BindingBuffer）、洗脫液（WashSolution）、EB緩沖液（ElutionBuffer）。83．連接反應(yīng)試劑T4DNA連接酶，試劑公司附送相應(yīng)的10×T4DNA連接酶buffer。4．大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化。5．重組質(zhì)粒的篩選試劑（1）Amp母液：取氨芐青霉素鈉溶于去離子水中，配成25mg/mL溶液。過濾滅菌，分裝儲存在-20℃。（2）LB液體培養(yǎng)基。（3）含Amp的LB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，瓊脂15g，加去離子水800ml，攪拌使其完全溶解，用5mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積為1000ml，高壓滅菌20min，冷卻至60℃左右，加入Amp母液，使終濃度為50μg/ml，搖勻后鋪板，4℃保存。96．異丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）將1gIPTG溶于4ml去離子蒸餾水中，定容至5ml，濃度為200mg/ml用0.22μm過濾器除菌，分裝成1ml小份，-20℃保存?zhèn)溆?，可保?個(gè)月。7．瓊脂糖凝膠電泳試劑8．蛋白電泳試劑9．DNAmarkerDL2000；DNAmarkerDL15000。10．標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker11．菌落PCR相關(guān)試劑dNTP(2.5mol/L)、TaqDNA聚合酶5U/μl，10×PCRbuffer（含MgCI2，濃度為25mmol/L）、dNTP混合物（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mmol/L），均購至試劑公司。1012．通用引物引物序列為：PGEX5’5’-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3’；PGEX3’5’-TATGGCTGATTATGATCAGT-3’。由引物合成公司合成，并根據(jù)合成的引物濃度，用滅菌雙蒸水將引物稀釋至5μmol/L的濃度。13．GlutathioneSepharoseTM4B微珠，購至試劑公司。11三、操作步驟12酶切目的基因與載體連接為重組DNA分子轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌抗藥性平板初篩篩選菌落PCR復(fù)篩確定為陽性克隆交叉PCR進(jìn)一步鑒定誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并SDS鑒定序列分析進(jìn)行確定在質(zhì)粒載體上進(jìn)行目的基因克隆表達(dá)的基本步驟是：1.目的基因擴(kuò)增根據(jù)NCBI提供的UU8型株基因組信息，篩選感興趣的目的基因，并應(yīng)用primer5

檢查是否含有BamH

Ⅰ和Not

Ⅰ酶切位點(diǎn)？是-去掉

示例應(yīng)用PCR技術(shù)獲得目的基因。瓊脂糖凝膠電泳確定擴(kuò)增效果。滿足要求后使用DNA純化試劑盒回收目的基因，待用。

13UU8型：全長0.88Mb，含有699個(gè)基因，表達(dá)650個(gè)蛋白質(zhì)2.目的基因和載體（pGEX-6p2質(zhì)粒）雙酶切

混合均勻后，經(jīng)離心機(jī)快速離心2s，以集中樣品，37℃水浴1h。3.酶切后載體和目的基因片段回收、純化

用DNA膠回收試劑盒回收、純化載體和目的基因片段。具體方法參照試劑盒說明書。14BamHⅠ（10U/L）

1μlNot

Ⅰ（10U/L）

1μl10×buffer

2μl質(zhì)粒/目的基因1μgddH2O補(bǔ)足體積至20μl4.載體質(zhì)粒與目的基因片段的連接

目的基因片段和載體片段按4︰1（摩爾比）進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)體系（25μl）。

混合均勻后，經(jīng)離心機(jī)瞬時(shí)，以集中樣品，16℃反應(yīng)16～20h，取出，-20℃保存，備作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。5.大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

取連接產(chǎn)物2μl加入已經(jīng)制備的-80℃保存的20μlXL1-Blue感受態(tài)菌體溶液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。1510×T4DNA連接酶buffer2.5μl目的基因片段0.4pmol載體DNA0.1pmolT4DNA連接酶1μlddH2O補(bǔ)足體積至25μl6.重組質(zhì)粒的篩選（1）將200μl轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含終濃度為50μg/mlAmp的LB固體培養(yǎng)基表面，置37℃培養(yǎng)箱30min后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)12～16h。（2）取出培養(yǎng)板，觀察菌落生長情況。（3）菌落PCR挑取選擇性培養(yǎng)基上生長的單個(gè)菌落，挑其一半制作菌液為PCR擴(kuò)增模板，以pGEX-6p2上下游引物為擴(kuò)增引物，菌落PCR反應(yīng)總體系為20ul，其中10Xbuffer2.0ul，dNTP（2.5mmol）1ul，上游primer(20umol/L)0.2ul，下游primer(20umol/L)0.2ul，TaqDNA酶(5U/ul)0.2ul，模板16.4ul（一般先加）。167.目的基因表達(dá)（1）確定為陽性克隆后將剩余半個(gè)菌落挑入3mLLB選擇性液體培養(yǎng)基(Amp50μg/ml)中，37℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)14h。（2）次日按1:50比例接種于20mLLB液體培養(yǎng)基，同樣條件培養(yǎng)約3h至A600達(dá)0.8~1.0。17

將各反應(yīng)體系混勻后瞬時(shí)離心，置于PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增參數(shù)具體如下：94℃預(yù)變性5min；95℃變性60s，54℃退火45s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。（4）瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

取PCR產(chǎn)物5μl，進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察，判定是否為陽性克隆，并記錄結(jié)果。8.結(jié)果判定

在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上，不帶有pGEX-6p2質(zhì)粒DNA的細(xì)菌，由于無Amp抗性，不能存活；而含有pGEX-6p2空載體和含有重組質(zhì)粒（帶插入基因片段的陽性重組子）的細(xì)菌均能存活。經(jīng)菌落PCR重新篩選，可獲得陽性克隆。在誘導(dǎo)劑作用下重組質(zhì)粒在工程菌中表達(dá)目的蛋白，結(jié)合SDS技術(shù)可鑒定蛋白表達(dá)情況。18（3）加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3h。（4）4℃，5000rpm離心20min，棄培養(yǎng)液收集菌體。（5）加入1mL裂解液，冰浴超聲6min裂解菌體；（6）4℃，5000rpm離心20min，分別收集上清和沉淀，上樣進(jìn)行12%SDS分析，考馬斯亮藍(lán)染色后分析蛋白表達(dá)形式，確定融合蛋白為可溶性蛋白或包涵體膜蛋白。四、注意事項(xiàng)1．酶切載體和目的基因的注意事項(xiàng)：（1）酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶切反應(yīng)。（2）酶切要在適宜溫度下進(jìn)行（常為37攝氏度）。（3）紫外光對DNA分子有切割作用，若需要從膠中回收DNA做測定，應(yīng)盡量縮短照射時(shí)間，并采用長波長紫外線（300-360nm）。（4）EB為強(qiáng)誘變劑，且有毒性，配置和使用時(shí)應(yīng)戴手套，并注意環(huán)境衛(wèi)生，避免實(shí)驗(yàn)室污染。192.質(zhì)粒載體與目的基因片段連接的注意事項(xiàng)（1）在粘性末端連接時(shí)，除載體與目的基因連接構(gòu)成重組體外，還有一定數(shù)量的載體自身環(huán)化形成空載體，這將產(chǎn)生轉(zhuǎn)化菌中較高的假陽性克隆背景。為了增加重組的比例，一般將目的DNA片段的摩爾數(shù)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3～10倍。（2）選用品質(zhì)好的T4DNA連接酶，實(shí)驗(yàn)中取酶時(shí)，應(yīng)將酶放在冰盒上，用完立即放回-20℃冰箱保存。商品化的連接酶反應(yīng)緩沖液購買后，最好先分裝，-20℃保存，以減少反復(fù)凍融的次數(shù)。203.大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化的注意事項(xiàng)：（1）全程注意無菌操作，防止雜菌和雜DNA的污染。（2）用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA濃度與質(zhì)量要有保證，需為共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA分子，一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。21（3）連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，因此在實(shí)際操作時(shí)，一般采用12℃～16℃，此時(shí)既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。4.SDS的注意事項(xiàng)（1）處理樣品時(shí)需沸水浴3min左右，以除去蛋白質(zhì)亞穩(wěn)態(tài)的聚合（2）PAMF、APS等試劑有一定的神經(jīng)毒性，需注意生物安全。（3）灌膠時(shí)不能有氣泡，以免影響電泳時(shí)電流的通過。22（3）轉(zhuǎn)化溫度（42攝氏度）及轉(zhuǎn)化時(shí)間一定要控制準(zhǔn)確。（4）轉(zhuǎn)化菌涂布平板時(shí)培養(yǎng)時(shí)間不能超過16小時(shí)，否則抗生素會被消耗掉，未轉(zhuǎn)化菌也會生長。五、實(shí)驗(yàn)意義使同學(xué)們基本掌握基因克隆與表達(dá)技術(shù)，為進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)?？寺〕鯱U基因并表達(dá)其蛋白，為后續(xù)研究UU的生物學(xué)特征奠定基礎(chǔ)。23[1]童偉,張戰(zhàn)軍