原發(fā)性開角型青光眼MYOC基因C1009缺失突變致病機(jī)理的研究課件

原發(fā)性開角型青光眼MYOC基因

C1009缺失突變致病機(jī)理的研究謝小兵湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院湖南郴州2012年8月原發(fā)性開角型青光眼MYOC基因

C1009缺失突變致病機(jī)理的1內(nèi)容綱要一、青光眼概述二、原發(fā)性開角型青光眼突變

基因篩查三、青光眼致病機(jī)理研究--基因功能研究（細(xì)胞/動(dòng)物水平）內(nèi)容綱要一、青光眼概述2一、青光眼概述疾病基本特征：病理性高眼壓、視神經(jīng)萎縮、視盤凹陷擴(kuò)大及進(jìn)行性視野缺損（視力減退）。病因：尚不清楚，一般認(rèn)為是由多種因素引起?，F(xiàn)認(rèn)為主要是由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致。發(fā)病情況：是世界上第二大致盲性眼病，僅次于白內(nèi)障。其分類有多種，其中近一半為原發(fā)性開角型青光眼（primaryopenangleglaucoma，POAG）。2010年全世界有6000多萬人患有POAG，其中有450萬人會(huì)失明。原發(fā)性繼發(fā)性開角型閉角型病因?qū)W前房角發(fā)病年齡嬰幼兒型青少年型成人型①②③一、青光眼概述疾病基本特征：病理性高眼壓、視神經(jīng)萎縮、視盤凹3前房的位置房水循環(huán)示意圖開角型青光眼示意圖閉角型青光眼示意圖前房形態(tài)前房的位置房水循環(huán)示意圖開角型青光眼示意圖閉角型青光眼示意圖4瞳孔睫狀肌后房前房前房角小梁網(wǎng)（Schlemm）集液管房水靜脈施萊姆氏管正常房水循環(huán)途徑瞳孔睫狀肌后房前房前房角小梁網(wǎng)（Schlemm）集液管房水靜5青光眼的遺傳傾向：大量的家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)，約13%～47%的開角型青光眼具有家族史，開角型青光眼發(fā)病率為2.8%～16.4%，遠(yuǎn)高于正常群體的發(fā)病率。青光眼的相關(guān)致病基因：目前至少發(fā)現(xiàn)7條染色體與POAG相關(guān)。MYOC基因是最先確定的與POAG相關(guān)的致病基因。1號(hào)染色體：MYOC基因：圖11號(hào)染色體結(jié)構(gòu)及MYOC基因結(jié)構(gòu)圖1q24～251號(hào)染色體：MYOC基因：圖11號(hào)染色體結(jié)構(gòu)及MYO6

已報(bào)道的與POAG有關(guān)的致病性MYOC基因突變已報(bào)道的與POAG有關(guān)的致病性MYOC基因突變7二、突變基因的篩查二、突變基因的篩查8（一）大型原發(fā)性開角型青光眼家系調(diào)查：

1.該家系共56人，其中男性27人，發(fā)病7人，女性29人，發(fā)病4人。2.MYOC基因突變篩查：RFLP、SSCP法篩查3.突變蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（一）大型原發(fā)性開角型青光眼家系調(diào)查：1.該家系共56人，9

研究發(fā)現(xiàn)在不同地區(qū)不同種族POAG的MYOC基因突變現(xiàn)象并不相同，MYOC90%的基因突變位于第3個(gè)外顯子。目前較肯定的與青光眼發(fā)病有關(guān)的突變有:Tyr437His（human)、Tyr423His(mouse)、Pro370Leu、Glu337Arg、Gly357Val等。1.TransgenicMiceExpressingtheTyr437HisMutantofHumanMyocilinProteinDevelopGlaucomaInvestOphthalmolVisSci.2008May;49(5):1932–1939.2.ExpressionofMutatedMouseMyocilinInducesOpen-AngleGlaucomainTransgenicMiceTheJournalofNeuroscience.November15,2006,26(46):11903–11914研究發(fā)現(xiàn)在不同地區(qū)不同種族POAG的MYOC基因10

實(shí)驗(yàn)分組：1.青光眼家系組(56人）2.正常對(duì)照組（200例）

入選標(biāo)準(zhǔn)：

⑴體檢健康者；⑵年齡20~60歲；⑶無青光眼家族史；⑷眼底及眼壓檢查正常者。實(shí)驗(yàn)分組：11突變篩查：2％瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物條帶①DNA的提?。和庵苎酶牧糔aI法提取模板DNA②PCR擴(kuò)增：引物設(shè)計(jì)：MYOC第一外顯子：6對(duì)引物；PCR產(chǎn)物分別命名為MYOC1～6；

MYOC第二外顯子：1對(duì)引物；PCR產(chǎn)物命名為MYOC7；MYOC第三外顯子：6對(duì)引物；PCR產(chǎn)物分別命名為MYOC8～13。③產(chǎn)物鑒定：突變篩查：2％瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物條帶①DNA的提取：外12④PCR產(chǎn)物酶切及突變分析：PCR-RFLP法共篩查了分布于MYOC基因三個(gè)外顯子的13個(gè)點(diǎn)突變，酶切產(chǎn)物經(jīng)8％PAGE鑒定。④PCR產(chǎn)物酶切及突變分析：PCR-RFLP法共篩查13氨基酸改變堿基改變PCR區(qū)段限制性內(nèi)切酶酶切片段（bp）結(jié)果Pro13LeuC38TMYOC1AsuI未突變突變155,191745例可疑Arg46TermC136TMYOC2BsuRⅠ未突變突變118,78196無異常Gln48HisG144TMYOC2BseNⅠ(BsrⅠ)未突變突變69,127196無異常Arg76LysG227AMYOC3Alw261(BsmAⅠ)未突變突變93,961893例可疑Asp208GluC624GMYOC7Alw261(BsmAⅠ)未突變突變57,17757,77,100無異常Gly246ArgG736AMYOC8BseLⅠ(BsiYⅠ)未突變突變48,129177無異常ln337stopC1009delMYOC10Bme1390Ⅰ未突變突變56,61,7356,13412例可疑Ile345MetA1036GMYOC10PagⅠ(BspHⅠ)未突變突變19084,106無異常Pro361SerC1081TMYOC10Bme1390Ⅰ未突變突變56,61,736,129無異常Gly367ArgG1099AMYOC10BseDⅠ(SecⅠ)未突變突變8,15,42,53，728,53,57,72無異常Asp380AsnG1138AMYOC11Tru1Ⅰ未突變突變19749,148無異常Ile477SerT1430GMYOC13NmuCⅠ(Tsp45Ⅰ)未突變突變73,10653,53,73無異常Pro481LeuC1442TMYOC13MnlⅠ未突變突變25,15425,74,80無異常所篩查的突變位點(diǎn)及酶切結(jié)果氨基酸堿基PCR區(qū)段限制性酶切片段（bp）結(jié)果Pro1314

具體酶切結(jié)果如下：

1.MYOC1片段全長174bp，檢測出了一個(gè)位于第一外顯子的新的點(diǎn)突變38C→T。未突變片段存在限制性內(nèi)切酶AsuI的酶切位點(diǎn)，突變后則該酶切位點(diǎn)消失。經(jīng)該酶消化完全后，可見明顯的雜合子條帶。該突變存在于家系的4例已確診病人和1例可疑者中，在對(duì)照組中未檢出。MYOC1片段AsuI酶切結(jié)果圖1：家系病人（（C,T）雜合子）2：正常對(duì)照組3：PCR產(chǎn)物M：DNAmarker具體酶切結(jié)果如下：

1.MYOC1片段全長174bp152.MYOC3片段全長189bp，未發(fā)生突變時(shí)有一個(gè)Alw261酶切位點(diǎn)，酶切后片段為93bp和96bp，若發(fā)生突變則酶切位點(diǎn)消失。經(jīng)酶切，發(fā)現(xiàn)酶切后片段為93bp、96bp和189bp者3例，為雜合子，由于93bp和96bp兩條片段只相差3bp，在8%的PAGE上分辨率比較低，只能觀察到重疊影。證實(shí)發(fā)生了G227T突變。MYOC3片段Alw261酶切結(jié)果圖1：雜合子2：純合子3：PCR產(chǎn)物M：DNAMarker2.MYOC3片段全長189bp，未發(fā)生突變時(shí)有一163.MYOC10片段全長190bp，未發(fā)生突變時(shí)有2個(gè)Bme1390Ⅰ酶切位點(diǎn)，酶切后片段為56bp、61bp和73bp，若發(fā)生1009位點(diǎn)突變，則酶切后片段為56bp和134bp。經(jīng)酶切，發(fā)現(xiàn)酶切后片段為56bp和134bp者2例，片段為56bp、61bp、73bp和134bp者10例，存在1009位點(diǎn)C堿基缺失突變。MYOC10片段酶切結(jié)果圖1：雜合子2：未突變產(chǎn)物3：純合子4：PCR產(chǎn)物M：DNAMarker3.MYOC10片段全長190bp，未發(fā)生突變時(shí)有17⑤陽性PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

將根據(jù)酶切篩選出的異常結(jié)果進(jìn)行雙向測序，測序表明在38位點(diǎn)C變?yōu)門，227位點(diǎn)G突變?yōu)锳，在1009位點(diǎn)發(fā)生C堿基缺失。

C38T（Pro13Leu）測序圖（箭頭所指為雜合子雙峰）⑤陽性PCR產(chǎn)物測序結(jié)果將根據(jù)酶切篩選出的異常18G227A(Arg76Lys)測序圖C1009del(Gln377stop)測序圖PCR產(chǎn)物測序結(jié)果G227A(Arg76Lys)測序圖C1009del19⑥統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在該56人的家系中，227G→A、C1009del和38C→T三種突變篩選情況如下表：

家系中三種突變的篩選情況突變確診(例）表型正常（例）合計(jì)（例）正常對(duì)照組（例）227G→A2130C1009del11112038C→T4150⑥統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在該56人的家系中，227G→A、C1009d20結(jié)論1.本研究在POAG家系中，共發(fā)現(xiàn)MYOC基因三個(gè)突變,分別是G227A、C1009del和C38T,其中后兩個(gè)突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)。2.G227A突變者3例，其中2例為已確診的POAG病人,1例為家系中表型正常人，對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)3.C1009del突變者12例，其中11例已經(jīng)確診POAG,在1例4歲的子代親屬中也發(fā)現(xiàn)該突變。正常對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)4.C38T突變存在于4例已確診的POAG病人和1例可疑者中，正常對(duì)照組中未檢出。這三個(gè)突變的發(fā)病率在家系組和正常對(duì)照有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.本研究在POAG家系中，共發(fā)現(xiàn)MYOC基因三個(gè)突變21C1009delFJ237047C1009delFJ23704722（二）蛋白結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析

（二）蛋白結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析23進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

（蛋白質(zhì)分析軟件Antheprot4.3）

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析：1.第227位點(diǎn)的堿基改變G→A導(dǎo)致第76位氨基酸由精氨酸變?yōu)橘嚢彼幔ˋrg76Lys）。G227A（Arg76Lys）突變前后氨基酸序列對(duì)比進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

（蛋白質(zhì)分析軟件Antheprot4.324

2.第1009位點(diǎn)的C堿基缺失(C1009del)導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)C1009del突變前后氨基酸序列對(duì)比

2.第1009位點(diǎn)的C堿基缺失(C1009del)導(dǎo)致終25C38T突變前后氨基酸序列對(duì)比3.對(duì)38位C堿基突變?yōu)門堿基，導(dǎo)致第13位氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼帷38T突變前后氨基酸序列對(duì)比3.對(duì)38位C堿基突變?yōu)?6G227A（Arg76Lys）突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測（DMP法）蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

1.G227A（Arg76Lys）突變前后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化G227A（Arg76Lys）突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測（D27C1009del突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測（DMP法）2.C1009del突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化C1009del突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測（DMP法）228C38T突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測對(duì)比（DMP法）3.C38T突變前后：

導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨基酸序列發(fā)生了改變（脯氨酸→亮氨酸），但并未造成蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)的明顯改變。C38T突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測對(duì)比（DMP法）29G227A（Arg76Lys）突變前后蛋白質(zhì)理化特性曲線

蛋白質(zhì)理化特性分析分析結(jié)果：突變前后蛋白質(zhì)的抗原性、親水性、疏水性、溶解性等理化性質(zhì)都未發(fā)生明顯改變G227A（Arg76Lys）突變前后蛋白質(zhì)理化特性曲線30C1009del突變前后蛋白質(zhì)理化特性曲線分析結(jié)果：蛋白質(zhì)的抗原性、親水性、疏水性、溶解性等理化性質(zhì)都發(fā)生了較大變化。C1009del突變前后蛋白質(zhì)理化特性曲線分析結(jié)果：蛋白31C38T突變前后蛋白質(zhì)理化特性曲線對(duì)比分析結(jié)果：蛋白質(zhì)的抗原性、親水性、疏水性、溶解性等理化性質(zhì)未發(fā)生明顯改變。C38T突變前后蛋白質(zhì)理化特性曲線對(duì)比分析結(jié)果：蛋白質(zhì)的抗原32結(jié)論1.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示G227A突變→Arg76Lys；C1009del導(dǎo)致氨基酸發(fā)生移碼突變；

C38T突變→Pro13Leu2.蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示G227A突變前后和C38T突變前后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)未發(fā)生明顯改變，而C1009del突變前后，蛋白的物理性質(zhì)發(fā)生了明顯變化，這些性質(zhì)變化可能影響了蛋白之間的相互反應(yīng)，可能與青光眼的發(fā)生相關(guān)。結(jié)論1.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示33MYOC基因突變致病機(jī)理？青光眼發(fā)生的分子機(jī)制？青光眼房水循環(huán)MYOC基因突變致病機(jī)理？青光眼房水循環(huán)34三、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞水平功能研究三、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞水平功能研究35（一）RNA干擾技術(shù)對(duì)MYOC基因

C1009del突變小梁細(xì)胞模型的構(gòu)建（一）RNA干擾技術(shù)對(duì)MYOC基因

C1009del突變小梁36流程流程371、目的基因RNA干擾慢病毒載體制備

針對(duì)目的基因靶序列，利用公用網(wǎng)站按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)多個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，選擇最佳靶點(diǎn)；1、目的基因RNA干擾慢病毒載體制備

針對(duì)38陽性克隆質(zhì)粒抽提：

瓊脂糖凝膠電泳圖：1號(hào)泳道：marker；10kb，9kb，8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1Kb，900bp，750bp，600bp，500bp2、3、4、5號(hào)泳道分別代表psc-1、psc-2、psc-3、psc-4質(zhì)粒載體；6號(hào)泳道代表pscNC（普適性陰參對(duì)照）質(zhì)粒載體。陽性克隆質(zhì)粒抽提：1號(hào)泳道：marker；10kb，9392、目的基因過表達(dá)載體構(gòu)建

1#：陰性對(duì)照（ddH2O）2#：陰性對(duì)照（空載組）3#：陽性對(duì)照（有確定插入片段的載體組）4#：Marker：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。5#-10#為pEGFP-N1-MYOC

PCR鑒定陽性克隆2、目的基因過表達(dá)載體構(gòu)建1#：陰性對(duì)照（ddH2O）40

使用293T細(xì)胞檢測融合基因是否表達(dá)

因真核表達(dá)載體pGFP－N1上含有綠色熒光蛋白GFP的基因，當(dāng)重組融合基因成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞后，如果融合基因能夠表達(dá)，則綠色熒光蛋白也被翻譯，從而細(xì)胞在熒光顯微鏡下可顯示綠色熒光，故可通過觀察綠色熒光的有無來判斷融合基因是否表達(dá)。熒光鏡檢與白光鏡下結(jié)果：293T細(xì)胞熒光鏡檢結(jié)果293T細(xì)胞白光鏡檢結(jié)果陽性克隆測序

使用293T細(xì)胞檢測融合基因是否表達(dá)熒光鏡檢與白光鏡下413、WesternBlot篩選RNAi有效靶點(diǎn)

構(gòu)建好含有目的基因的過表達(dá)克隆質(zhì)粒和針對(duì)靶基因不同干擾靶點(diǎn)的RNAi病毒載體質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的工具細(xì)胞（即293T細(xì)胞），轉(zhuǎn)染24h熒光顯微鏡下觀測轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染36～48h收集細(xì)胞抽提蛋白，采用Westernblot檢測目的蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)而判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果。3、WesternBlot篩選RNAi有效靶點(diǎn)42原發(fā)性開角型青光眼MYOC基因C1009缺失突變致病機(jī)理的研究課件43WesternBlot結(jié)果掃描（第一次實(shí)驗(yàn)的knockdown檢測）WesternBlot結(jié)果掃描（第二次實(shí)驗(yàn)的knockdown檢測）注釋：PC：加入pcDNA3.1質(zhì)粒；NC1：對(duì)照組1，不含干擾靶點(diǎn)的敲減質(zhì)粒；NC2：對(duì)照組2，含有紊亂序列的敲減質(zhì)粒；1＃，2＃，3＃，4＃：含有不同干擾靶點(diǎn)的敲減質(zhì)粒；0.5μg，1.0μg：加入的質(zhì)粒量（1）293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)（2）WesternBlot檢測目的基因表達(dá)水平WesternBlot結(jié)果掃描WesternBlot44結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)并構(gòu)建4個(gè)針對(duì)目的基因的4個(gè)干擾質(zhì)粒，通過兩次篩靶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看到，1#，2#和3#對(duì)MYOC有敲減作用，在兩個(gè)質(zhì)粒濃度下的作用基本是一致的。此外，4#也有一些作用，特別是在高濃度下，隨機(jī)選擇3#干擾靶點(diǎn)(PSC413)進(jìn)行慢病毒大量包裝。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)并構(gòu)建4個(gè)針對(duì)目的基因的454、檢測小梁細(xì)胞MYOC基因KnockDown效率

細(xì)胞總RNA抽提：RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNAReal-timePCR檢測4、檢測小梁細(xì)胞MYOC基因KnockDown效率細(xì)胞總46定量PCR擴(kuò)增曲線第一次

定量PCR擴(kuò)增曲線-第二次

定量PCR擴(kuò)增曲線第一次定量PCR擴(kuò)增曲線-第二次47結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖-第一次

結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖-第二次

注：CON:未感染任何病毒的小梁細(xì)胞；KL376:感染過表達(dá)MYOC慢病毒的細(xì)胞；KL376+NC:陰性對(duì)照；KL376+KD:感染針對(duì)MYOC的RNAi慢病毒的細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖-第一次結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖-第二次注：CON:未感染48Westernblot

檢測KD效率

準(zhǔn)備靶細(xì)胞慢病毒感染靶細(xì)胞提取感染靶細(xì)胞的總蛋白Westernblot

從圖可見在<90KD處出現(xiàn)陽性條帶。認(rèn)為該條帶就是目的蛋白的條帶。該圖顯示：靶點(diǎn)感染組（標(biāo)注為413）相對(duì)陰性對(duì)照組（標(biāo)注為NC），陽性條帶更弱，表明靶點(diǎn)組目的蛋白表達(dá)水平下調(diào)。因此psc413是有效的RNAi靶點(diǎn)。（CON：未感染過表達(dá)MYOC病毒的小梁細(xì)胞）無條帶，細(xì)胞本底基本不表達(dá)MYOC基因，成功構(gòu)建了小梁細(xì)胞模型。Westernblot檢測KD效率準(zhǔn)備靶細(xì)胞從49（二）MYOC基因C1009del的定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變技術(shù)是蛋白質(zhì)工程中采用的重要技術(shù)之一，它是在已知基因的預(yù)定位點(diǎn)通過替換、插入或缺失一定長度的核苷酸片段，精確地改變基因的特定堿基序列，從而研究基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，從微觀水平上闡述正常狀態(tài)下基因調(diào)控機(jī)理及與疾病的關(guān)系。

（二）MYOC基因C1009del的定點(diǎn)突變501、構(gòu)建青光眼相關(guān)基因MYOC的C1009del突變（1）感受態(tài)細(xì)胞的制備（2）MYOC基因C1009del突變質(zhì)粒載體的構(gòu)建對(duì)陽性菌落的基因用引物EGFP-N-R進(jìn)行測序分析，其測序結(jié)果如下：

測序結(jié)果顯示成功完成了MYOC基因C1009del的定點(diǎn)突變（3）陽性重組體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞1、構(gòu)建青光眼相關(guān)基因MYOC的C1009del突變（1）512、小梁細(xì)胞的培養(yǎng)小梁細(xì)胞：來源于本實(shí)驗(yàn)室液氮中的保種細(xì)胞。用G418進(jìn)行細(xì)胞篩選G418一種氨基糖苷類抗生素。在分子遺傳實(shí)驗(yàn)中,是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞DNA后,則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。

G418的這一選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用。2、小梁細(xì)胞的培養(yǎng)小梁細(xì)胞：來源于本實(shí)驗(yàn)室液氮中的保種細(xì)胞。52正常生長的小梁細(xì)胞（未用G418篩選前）

陰性對(duì)照細(xì)胞（未導(dǎo)入突變基因）

含300μl/mlG418的培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)含400μl/mlG418的培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)含500μl/mlG418的培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)含700μl/mlG418的培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)小梁細(xì)胞：來源于本實(shí)驗(yàn)室液氮中的保種細(xì)胞。利用不同濃度的G418篩選10天后的單個(gè)視野中小梁細(xì)胞

正常生長的小梁細(xì)胞陰性對(duì)照細(xì)胞含300μl/mlG418的53

在第14天時(shí)觀察細(xì)胞長勢(shì)，發(fā)現(xiàn)G418終濃度：

≥400μl/ml，小梁細(xì)胞全部凋亡，看不到貼壁細(xì)胞；=300μl/ml，尚有貼壁存活的小梁細(xì)胞。因此，決定400μl/ml的G418濃度作為后續(xù)篩選導(dǎo)入突變基因的小梁細(xì)胞的濃度。在第14天時(shí)觀察細(xì)胞長勢(shì)，發(fā)現(xiàn)G418終濃54四、動(dòng)物水平基因功能研究（一）轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建（1）構(gòu)建MYOC基因C1009缺失突變過表達(dá)載體（2）DNA顯微注射

四、動(dòng)物水平基因功能研究（一）轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建55DNA顯微注射1.促排和取卵：人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)母鼠排卵，和雄鼠合籠，用頸椎脫臼法處死有陰道栓的雌鼠，在解剖鏡下找出輸卵管傘部，解剖出受精卵。2.不育雄性公鼠：結(jié)扎公鼠假孕雌性母鼠：在正式實(shí)驗(yàn)前，結(jié)扎公鼠需與性成熟的雌性小鼠交配，該雌性小鼠為假孕雌性母鼠。3.受精卵注射外源DNA：顯微操作儀、顯微持卵針和顯微注射針。4.注射后的受精卵移植至受孕后0.5天的假孕母鼠的輸卵管內(nèi)DNA顯微注射1.促排和取卵：人絨毛膜促性腺激素(hCG)56（二）驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因小鼠是否為原發(fā)性開角型青光眼模型（1）測定IOP（2）小梁網(wǎng)細(xì)胞及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的退行