微核的形成與遺傳毒性

微核的形成與遺傳毒性

微核（mcn）是真核生物細(xì)胞的異常結(jié)構(gòu)，也是間期細(xì)胞形態(tài)的特征。一般認(rèn)為,微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體片斷產(chǎn)生的。在細(xì)胞有絲分裂時,受到有害理化因子的損傷,染色體發(fā)生斷裂,在下一次分裂后期,喪失著絲粒的染色體片斷行動滯后,不能進(jìn)入子細(xì)胞的主核,形成滯留在核外的微小染色質(zhì)塊,即微核。有些研究者認(rèn)為,微核可以是細(xì)胞凋亡的產(chǎn)物,當(dāng)致畸因素導(dǎo)致凋亡基因激活,內(nèi)切酶激活,切割DNA,形成細(xì)胞核碎片,最終導(dǎo)致產(chǎn)生許多微核。微核的形成是細(xì)胞受遺傳毒物作用后的一種遺傳學(xué)終點,以觀察細(xì)胞中微核的形成來檢測遺傳毒物,稱為微核試驗。微核試驗是以動植物為材料,利用細(xì)胞生物學(xué)方法觀察其出現(xiàn)的微核率(micronucleusfrequency,MNF)來表示材料受遺傳損傷程度的一種檢測遺傳毒物的方法。微核試驗創(chuàng)建于20世紀(jì)80年代,目前許多國家和國際組織已將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品等毒理安全性評價的必做試驗。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,大大拓展了微核試驗的檢測和應(yīng)用范圍,已發(fā)展成為能同時檢測染色體斷裂、丟失、分裂延遲、不分離、DNA損傷修復(fù)障礙、HPRT基因突變、凋亡、細(xì)胞分裂不平衡等多種遺傳終點,因而近年來國際上有人提出了新微核試驗的概念,從而使微核試驗煥發(fā)出新的生機(jī)。1影響微核生成的因素1.1ca2+依賴內(nèi)切酶基因表達(dá)是造成細(xì)胞凋亡的一個重要因素在正常情況下,生物也會自然出現(xiàn)較低頻率的微核,在人類中一般會隨年齡的增大而增加,往往女性高于男性。主要是和自身的免疫力低下以及超氧化物、自由基、易氧化物等因素較多有關(guān)。微核也是細(xì)胞凋亡的產(chǎn)物,當(dāng)程序性死亡基因激活,隨之Ca2+依賴性內(nèi)切酶激活,切割DNA,形成細(xì)胞核碎片,形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為核深染,染色質(zhì)邊緣分布的帽形核,最后導(dǎo)致微核形成。一些研究表明,caspase-3除了在細(xì)胞凋亡途徑中作為效應(yīng)因子外,也與微核的形成有關(guān)。此外,有研究表明,細(xì)胞內(nèi)P53的含量對于苯誘導(dǎo)的微核形成有影響。1.2對hlt-6細(xì)胞微核試驗和基因型的檢測化學(xué)誘變劑可分為染色體斷裂劑和非整倍體劑。這類物質(zhì)較多,如苯三酚(1,2,4-苯三酚,BT)在氧化成酮時產(chǎn)生活性氧損傷DNA和其他一些細(xì)胞大分子,BT能使淋巴細(xì)胞微核率上升2倍,使Hlt-6細(xì)胞微核率上升8倍,且總微核數(shù)在兩類細(xì)胞中呈劑量相關(guān)性。BT不僅引起染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化,而且可通過產(chǎn)生活性氧而間接引發(fā)點突變。紡錘絲毒性藥物如秋水仙堿、HO-221等能直接抑制動物細(xì)胞紡錘絲的形成,阻止細(xì)胞分裂后期紡錘絲將染色體拉至細(xì)胞的兩端從而形成微核。Ando等應(yīng)用抗腫瘤藥(HO-221)抑制小鼠細(xì)胞紡錘絲微管組裝,破壞紡錘體,結(jié)果誘導(dǎo)出多倍體和亞二倍體細(xì)胞以及較大的微核。1.2.1胞的二極、正常核細(xì)胞核的主要成分是染色體,在正常的情況下細(xì)胞分裂時染色體被紡錘絲牽引平均分向細(xì)胞的二極,形成二個正常的核。在染色體斷裂劑存在的情況下,染色體發(fā)生斷裂,并不發(fā)生重接或不在原處重接,則形成了無著絲粒的斷片,在細(xì)胞分裂后期不能向兩極移動,而殘留在細(xì)胞中央的赤道板附近,當(dāng)子細(xì)胞形成時則游離于細(xì)胞質(zhì)中形成不含著絲粒的微核。1.2.2非肽模擬酶檢測細(xì)胞微核試驗和水解反應(yīng)該物質(zhì)可以使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)發(fā)生障礙或紡錘體功能受損。在細(xì)胞分裂時,染色體不發(fā)生分離而產(chǎn)生非整倍體子細(xì)胞,同時在赤道板中央殘留一條或多條染色體,它們在子細(xì)胞形成時不能被包在子核中,而游離于細(xì)胞質(zhì)中形成含著絲粒的微核。一般的遺傳毒性物質(zhì)兼有染色體斷裂劑和非整倍體劑兩方面的作用。RPR-115135是一種新的非肽模擬酶(法尼基轉(zhuǎn)移酶)的抑制劑,在不影響細(xì)胞膜完整性的濃度水平誘導(dǎo)微核頻率地顯著增加。RPR-115135使CREST+與CREST-微核比例顯著增加,RPR-115135作為一種非整倍體劑,其作用依賴于腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)基因的突變互補(bǔ),這種活性與ras基因型無關(guān)。1.3纖維素在不同給藥后微核試驗和半胱氨酸對小鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響VB12、葉酸缺乏可引起微核。有人對9位健康志愿者進(jìn)行了葉酸限量試驗,從基礎(chǔ)用量的195mg/(L·d),減到每天56mg,維持5周,然后,慢慢補(bǔ)充葉酸。減量后的雙核淋巴細(xì)胞和全系淋巴細(xì)胞內(nèi)的微核頻率均增高,且有著絲點陽性和陰性的微核都增加;當(dāng)葉酸補(bǔ)充后,兩類細(xì)胞微核率明顯下降,著絲點陽性微核變化更為顯著。試驗表明,低葉酸貧血癥在臨床貧血癥狀之前就出現(xiàn)了血液和口腔粘膜細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷。當(dāng)葉酸和VB12的攝入量是基礎(chǔ)量的3.5倍時,微核率明顯降低。半胱氨酸濃度過高也可引發(fā)微核,當(dāng)血漿中半胱氨酸濃度低于7.5mmol/L時,微核率最低。谷胱甘肽、VC、VE、硒以及抗氧化酶類(如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶)等具有降低微核產(chǎn)生的能力,主要是它們可以清除體內(nèi)的超氧化物等物質(zhì)。GiriA等研究認(rèn)為,Vc有預(yù)防順鉑誘導(dǎo)鼠致畸的作用,聯(lián)合使用VC和順鉑這兩類藥物,發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓細(xì)胞微核、染色體畸變等指標(biāo)明顯低于單獨(dú)使用順鉑。有趣的是,他們還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療過程中,鼠骨髓細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)水平也明顯增高,可解釋Vc保護(hù)細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)畸變的機(jī)理。1.4-射線結(jié)合應(yīng)用放射線可以引起DNA損傷,導(dǎo)致微核出現(xiàn)。暴露在超低頻磁場對自發(fā)和X-射線誘發(fā)的微核數(shù)無影響。但是在X-射線輻射之后暴露在超低頻磁場,在CHO細(xì)胞可加速X-射線誘導(dǎo)的整條染色體(或著絲粒片斷)的延滯。此外,γ-射線也能夠引起明顯的微核增加。將老鼠在靜磁場中暴露,微核頻率顯著增加,并且與劑量相關(guān)。一些研究者認(rèn)為,微核數(shù)增加可歸因于由靜磁場引起的應(yīng)急反應(yīng)或靜磁場的直接斷裂與紡錘體干擾效應(yīng)。2微核技術(shù)的發(fā)展2.1小鼠雙核細(xì)胞形態(tài)的表現(xiàn)1985年Fenech等建立的方法,用胞質(zhì)分裂阻滯劑阻斷胞質(zhì)分裂,但不影響細(xì)胞核分裂,有絲分裂細(xì)胞呈特殊形態(tài)的雙核細(xì)胞,未發(fā)生核分裂的細(xì)胞則維持單核細(xì)胞形態(tài)。檢測致突變因素作用后的雙核細(xì)胞率和雙核細(xì)胞微核率,可同時獲得致突變因素對細(xì)胞的遺傳毒性損害和對細(xì)胞周期影響的信息。在胞質(zhì)阻斷微核試驗中,會出現(xiàn)核質(zhì)橋(nucleoplasmicbridges,NPB),NPB是由雙著絲粒染色體和有著絲粒的環(huán)狀染色體在細(xì)胞分裂后期形成的。2.2自動微芯檢測方法2.2.1流式細(xì)胞儀檢測mn流式細(xì)胞儀(Flowcytometry)檢測方法是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的定量測定細(xì)胞和亞細(xì)胞成分的方法。流式細(xì)胞儀是利用激光束為光源,將待測樣品進(jìn)行熒光染色,然后在液體載體里以單個細(xì)胞通過激光束,產(chǎn)生熒光信號并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柾ㄟ^儀表顯示來達(dá)到定量測定的目的。流式細(xì)胞儀檢測MN有很多優(yōu)點:①檢測速度至少比人工讀片快40~100倍。②減少了人為的主觀因素。③新型流式細(xì)胞儀具有分選功能,對判定為含MN的細(xì)胞,可以分類檢出并收集在玻片上或試管里,在顯微鏡下檢查驗證,以證實其真實性并計算其可置信度。2.2.2計算每點圖像時差的定量參數(shù)計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)是將高分辨力攝像機(jī)和計算機(jī)結(jié)合起來將圖像分解為若干點,再將每個點的圖像色差轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號,儲存在計算機(jī)里進(jìn)行各定量參數(shù)的計算。從20世紀(jì)80年代中期開始利用計算機(jī)圖像分析技術(shù),其檢測速度也至少比人工計算快10倍以上,但容易受條件因素影響,還需進(jìn)一步完善。3微芯染色組成分析技術(shù)3.1熒光原位雜交試驗熒光原位雜交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)技術(shù)是近年來開展起來的分子生物學(xué)新技術(shù)。它是使用生物熒光素標(biāo)記的各類DNA和RNA探針與細(xì)胞或組織在玻片上進(jìn)行原位雜交,被觀察的特定DNA片段(或序列)在熒光顯微鏡下固定在細(xì)胞核或染色體的原有部位顯示熒光。利用熒光原位雜交試驗可以檢測出是染色體斷裂還是丟失,以及可以判斷是哪一條染色體、哪一段所產(chǎn)生的微核。目前已成功用于MN試驗的DNA探針主要有2類:第一類是含DNA重復(fù)序列的探針,主要用于檢測染色體著絲粒的DNA;第二類是含染色體端粒DNA序列的探針,它主要顯示染色體臂的存在。若2種探針結(jié)合使用,則可以較為準(zhǔn)確地判斷MN的組成情況,即是染色體段片還是整條染色體,以及各自的數(shù)目。目前,在原位雜交的基礎(chǔ)上又發(fā)展出了多彩色熒光原位雜交技術(shù),它使用幾種不同的熒光素單獨(dú)或混合標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交,在熒光顯微鏡下顯現(xiàn)不同的顏色,因而可以同時檢測間期或中期細(xì)胞中的幾個特異核酸序列。它可以廣泛應(yīng)用于物理圖譜繪制、致突變研究、腫瘤病理和產(chǎn)前診斷等方面。3.2種自動抗體(CREST染色)抗著絲粒抗體(Anti-kinetochoreantibodies)是美國學(xué)者M(jìn)oroi及其同事于1980年在硬皮病病人血清中發(fā)現(xiàn)的一種自動抗體,這些自動抗體可以通過免疫熒光技術(shù)檢測到。它們與染色體著絲粒蛋白(抗原)成分相結(jié)合,具有較強(qiáng)的特異性。但并非所有硬皮病病人的血清中都含有該自動抗體,含該抗體的病人皮膚損害往往并不嚴(yán)重和廣泛,但卻有顯著的CREST征。所以,將用該種病人的血清對染色體著絲粒的染色直接稱為CREST染色(CRESTstaining)。CREST染色用來區(qū)分MN來源(染色體斷片還是整條染色體),了解誘導(dǎo)MN的化合物性質(zhì)(斷裂劑還是整倍體劑)。4為行政管理部門服務(wù)微核試驗廣泛應(yīng)用于藥品、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)化學(xué)品、環(huán)境污染物等遺傳毒性的檢測、安全性評價和遺傳損害的監(jiān)測,為接觸有害物質(zhì)的人群提供遺傳損害檢測和工作環(huán)境監(jiān)測,為行政管理部門的決策、立法奠定理論依據(jù)。4.1走惡勢力環(huán)境檢測污染物對人體或生物產(chǎn)生的損害可以方便快速地通過微核檢測出來。在普查致畸、致癌、致突變物等方面應(yīng)用廣泛,如物理因子(射線)、化學(xué)因子(毒物)、生物因子(毒素),空氣中污染的氣體,工業(yè)、生活污水,洗滌劑,重金屬,農(nóng)藥等致突變物的檢測。目前全世界已檢出的有毒物質(zhì)近500種。蠶豆根尖微核技術(shù)作為水污染檢測方法,早在1988年就被國家環(huán)保局批準(zhǔn),由許多研究表明,蠶豆根尖微核技術(shù)在檢測流域或湖泊水污染方面,有非常好的效果,有關(guān)這方面的研究較多。4.2細(xì)胞微核檢測化療后機(jī)體的淋巴細(xì)胞及骨髓細(xì)胞微核率會明顯上升,這些可以反映化療后的遺傳損傷程度。E1ias-L等對15例化療或放療急淋兒童外周血淋巴細(xì)胞微核變化進(jìn)行分析,用長春新堿、甲基喋啉、柔紅霉素、強(qiáng)的松化療和首次強(qiáng)化療末期使用了頭部放療的病人,他們的淋巴細(xì)胞微核明顯高于對照組,6例作了2年治療期動態(tài)觀察,多數(shù)病人治療期淋巴細(xì)胞微核頻率顯著增高。因而認(rèn)為,微核檢測法是評價抗白血病化療藥物誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞遺傳學(xué)損傷的有效方法。微核是遺傳損害的生物標(biāo)志物,用于癌癥患者、腫瘤患者等放射劑量的估算及放射事故的事后遺傳損傷檢測。有文獻(xiàn)介紹,用細(xì)胞阻斷微核分析法評價放射治療8位病人后的淋巴細(xì)胞輻射線損傷情況,結(jié)果治療后,每500個雙核細(xì)胞的微核平均值明顯高于治療前的對照細(xì)胞。4.3小鼠骨髓異常病變反應(yīng)mds的診斷價值在誘變因子和致癌物下的特定人群的血液淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞的微核率會明顯上升。通過上皮細(xì)胞的微核數(shù)量變化可快速安全地早期檢測癌變或預(yù)報受損傷程度。大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院檢驗科王永才教授主持的一項課題“微核測定和DNA含量分析對骨髓異常增生綜合征(MDS)早期診斷的應(yīng)用研究”,在患者臨床無任何癥狀,惡性細(xì)胞出現(xiàn)之前即可快速、準(zhǔn)確地預(yù)測MDS。骨髓異常增生綜合征(MDS)又稱白血病前期,其中約30%的MDS可演變成白血病。淋巴細(xì)胞微核檢測是一種快速敏感的測定機(jī)體損傷的早期生物學(xué)反映指標(biāo),也是腫瘤早期檢測的診斷指標(biāo)。4.4用于肺癌藥物的斷劑將待測物質(zhì)用微核檢測方法進(jìn)行分析,根據(jù)微核率發(fā)生情況來判斷物質(zhì)的抗癌性。該方法已經(jīng)進(jìn)行了一些研究,有望應(yīng)用于抗癌藥物的篩選。此外,有人將微核技術(shù)與熒光分光法結(jié)合起來,研究小分子對DNA的作用,從而篩選對癌細(xì)胞有作用的藥物分子。4.5影響本地植物的地球化學(xué)目前,微核技術(shù)已經(jīng)用于研究外來生物,如紫莖澤蘭、微甘菊等分泌的化學(xué)物質(zhì)對本地其他植物的影響。通過蠶豆根尖微核試驗表