應(yīng)用微生物學(xué)2

第五章應(yīng)用微生物的基因操作系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)釀酒酵母系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)的特點(diǎn)載體

質(zhì)粒載體噬菌體載體粘粒(cosmid)載體受體感受態(tài)(competance)細(xì)胞轉(zhuǎn)化大腸桿菌系統(tǒng)的特點(diǎn)基因工程是從大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)展起來(lái)的生長(zhǎng)迅速技術(shù)成熟基因組測(cè)序完成大腸桿菌系統(tǒng)的質(zhì)粒載體第一代質(zhì)粒載體：pBR322第二代質(zhì)粒載體：pUC質(zhì)粒第三代質(zhì)粒載體pBR322早期應(yīng)用廣泛的克隆載體，4362bp，有Ap和Tc兩個(gè)抗藥性基因單一切點(diǎn)的限制酶：AvaI,PstI,BamHI,PvuII,ClaI,SalI,EcoRI,HindIIIAp:PstITc:BamHI,HindIII,SalIpBR322載體重組子的篩選ApsTcsApTc+CycSAprTcr------

AprTcr-----------

AprTcsAprTcsAprTcsD-cycloserin:D-Ala（細(xì)胞壁組分之一）的結(jié)構(gòu)類似物pUC質(zhì)粒Ap抗性LacOZ中有多克隆位點(diǎn)(MCS)，可在X-gal平板上直接挑選

5溴,4氯,3吲哚－β－半乳糖苷（無(wú)色）

β－半乳糖苷酶（藍(lán)色）第三代質(zhì)粒載體pBR322（復(fù)制原點(diǎn)，抗藥性）T-噬菌體啟動(dòng)子、Lac啟動(dòng)子多克隆位點(diǎn)His尾穿梭質(zhì)粒質(zhì)粒一般只能在特定的寄主中復(fù)制，能穿梭于不同寄主中復(fù)制的質(zhì)粒稱為穿梭質(zhì)粒。大腸桿菌系統(tǒng)的成熟性，帶來(lái)了穿梭質(zhì)粒載體使用上的方便性。λ噬菌體類載體可容納的較大的外源DNA片段進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞容易能裂解宿主細(xì)胞，提取容易組建的DNA或cDNA文庫(kù)易于長(zhǎng)期保存

λ噬菌體基因組

雙鏈DNA,48502bp,50基因

EcoRI(12bp)cosAFJattintrecNCIPQSRcos

頭尾合成重組區(qū)調(diào)節(jié)區(qū)復(fù)制區(qū)裂解區(qū)

J-N為非必須區(qū)，與噬菌體生長(zhǎng)及噬斑形成無(wú)關(guān)，可被消除或取代，當(dāng)λ-DNA分子大小為其全長(zhǎng)的78%-108%(38~52kb)時(shí)，可以形成感染性噬菌體顆粒。λ噬菌體類載體的構(gòu)建用突變、缺失等方法，減少限制酶的切割位點(diǎn)，除去必須區(qū)內(nèi)的限制酶位點(diǎn)。

EcoRISIligase在非必須區(qū)內(nèi)進(jìn)行基因操作，切除一定的DNA片斷，有目的的引入一些DNA片斷。插入型載體λ噬菌體基因組的非必須區(qū)內(nèi)對(duì)使用的限制酶有一個(gè)酶切位點(diǎn)，DNA重組時(shí)外源DNA將在這個(gè)位點(diǎn)插入。

EcoRIb538

CIimm434整個(gè)基因組缺失18%，最大插入為9kbCI:編碼使噬菌體不能復(fù)制的阻遏蛋白，噬菌斑混濁，插入后CI失活，噬菌斑透亮取代型載體λ噬菌體基因組的非必須區(qū)內(nèi)對(duì)使用的限制酶有2個(gè)酶切位點(diǎn)，DNA重組時(shí)外源DNA將取代這2個(gè)位點(diǎn)間的片段。

EcoRIEcoRISupE整個(gè)基因組缺失27%，可插入3-18kbSupE，抑制基因，抑制LacZ基因的amber突變體，在X-gal平板上產(chǎn)生藍(lán)色噬菌斑,取代后噬菌斑無(wú)色λ噬菌體載體與外源DNA重組

粘粒(cosmid)載體插入外源DNA片斷的大?。嘿|(zhì)粒：<10kb

噬菌體：10-20kb

粘粒：40kb粘粒(5-10kb):COS+抗藥性基因+限制酶單切位點(diǎn)粘粒限制酶酶切連接外源DNA(ligase)體外包裝（需要2株帶λ溶源突變體的E.coli，凍融后提取包裝所需的各種蛋白質(zhì)）感染受體細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化感受態(tài)：細(xì)胞處于一種特殊的生理狀態(tài)，在這種狀態(tài)下可以吸收外源DNA。感受態(tài)的出現(xiàn)：（1）一種可擴(kuò)散的感受態(tài)因子的存在；（2）細(xì)胞外層的一些組分，如膜蛋白等狀態(tài)的變化。有些細(xì)胞在生長(zhǎng)的某一階段會(huì)自發(fā)出現(xiàn)感受態(tài)，但基因工程中所用的微生物在正常培養(yǎng)條件下不會(huì)自發(fā)出現(xiàn)感受態(tài)，需要經(jīng)過(guò)人工的特殊處理。大腸桿菌的感受態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程：細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期冷凍離心收集細(xì)胞CaCl2濃縮冰浴再冷凍離心收集細(xì)胞CaCl2再濃縮4°C放置

感受態(tài)細(xì)胞與DNA混合冰浴熱沖擊選擇性平板37°C培養(yǎng)機(jī)制：二價(jià)陽(yáng)離子(CaBaSrMg)改變了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使之在低溫時(shí)能與DNA結(jié)合，熱脈沖使結(jié)合在膜上的DNA有0.1%-1%可以抗DNase，并使抗DNase的DNA進(jìn)入細(xì)胞。

轉(zhuǎn)化效率衛(wèi)星菌落

受體菌基因工程受體菌的要求有能有效接受外源DNA的手段（轉(zhuǎn)化、感染、結(jié)合…）外源DNA能忠實(shí)地進(jìn)行復(fù)制（一般應(yīng)是rec-,r-,m-）有利于基因操作與生產(chǎn)的性狀（鑒別、生長(zhǎng)、分泌、后處理等）生物學(xué)安全性（不在人體內(nèi)生存，不在非培養(yǎng)條件下生存，不易轉(zhuǎn)移等）安全受體菌E.coliX1776F--無(wú)性因子

tonA53-抗噬菌體T1、T5、Ф80dapD8-二氨基庚二酸缺陷型minA1,minA2-產(chǎn)微細(xì)胞supE42-限制質(zhì)粒任意轉(zhuǎn)移，只要質(zhì)粒上有amber突變，則只能在有amber突變抑制基因的宿主中復(fù)制

40[gal-uvrB]-作為受體轉(zhuǎn)化能力增強(qiáng)λ–-無(wú)λ噬菌體nalA25-萘啶酮酸抗性，便于監(jiān)視thyA57-胸腺嘧啶缺陷型，與dap一起，無(wú)dap、thy時(shí)易死亡，使DNA更易分解

29[bioH-asd]-生物素缺陷-天冬氨酸半醛缺陷，中間有不能利用甘油、麥芽糖、需要蘇氨酸、甲硫氨酸等cycA1,cycB2-環(huán)絲氨酸抗性，便于監(jiān)視，自然界幾乎沒有兼抗nal、cyc兩種藥物的Rfb-2-粗糙突變體，對(duì)膽汁酸、離子去污劑、抗生素敏感hadR2-對(duì)外源DNA無(wú)限制作用啟動(dòng)子

TTGACATATAAT結(jié)構(gòu)基因

-35-10SD序列terminatorRNA聚合酶(

)Pribnowbox轉(zhuǎn)錄開始回文序列識(shí)別位點(diǎn)

結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶：

’

：識(shí)別，：保持構(gòu)型，：起始催化，

’：與DNA模板結(jié)合SD序列：Shine-Dalgarmobox，富含AT(Tm低)，翻譯時(shí)mRNA與核糖體16sRNA結(jié)合位點(diǎn)真核基因的表達(dá)問(wèn)題真核基因有內(nèi)含子，一起轉(zhuǎn)錄后得到錯(cuò)誤翻譯產(chǎn)物真核基因無(wú)SD序列，翻譯時(shí)缺少16S核糖體的結(jié)合位點(diǎn)真核蛋白質(zhì)易被細(xì)菌蛋白酶降解而得不到產(chǎn)物對(duì)策用cDNA克隆的策略或用RT-PCR獲得基因，即不含內(nèi)含子將真核基因克隆在原核啟動(dòng)子的下游，以利用SD序列用蛋白酶缺陷型宿主或克隆蛋白酶抑制劑基因，或使產(chǎn)生融合蛋白然后再加工成所需蛋白釀酒酵母系統(tǒng)釀酒酵母系統(tǒng)的特點(diǎn)可食、安全，適用于藥品生產(chǎn)遺傳背景最清楚的真核細(xì)胞在簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速、細(xì)胞密度高基因操作容易可分泌胞外蛋白可正確表達(dá)真核基因產(chǎn)物酵母載體游離(episomal)載體與整合(integrating)載體ARS(autonomousreplicationsequences)載體ARS/CEN(centromericsequences)2

質(zhì)粒類載體(2-basedvector)整合型載體人工染色體(yeastartificialchromosomeYAC)ARS載體拷貝數(shù)較多（可達(dá)20）有絲分裂時(shí)不穩(wěn)定（20%/代），甚至在有選擇性壓力下有質(zhì)粒細(xì)胞的比例也很低難于用來(lái)表達(dá)外源基因ARS/CEN加上著絲序列穩(wěn)定性增加拷貝數(shù)減少（1-2)只能在要求表達(dá)水平不高時(shí)使用2

質(zhì)粒存在于多數(shù)酵母菌中的內(nèi)源質(zhì)?？截悢?shù)高（~100）遺傳穩(wěn)定（10-4/代）大小為6.3kb（6318bp），有2個(gè)599bp的反向重復(fù)序列，編碼4個(gè)基因：A(FLP):編碼位點(diǎn)專一的重組酶，啟動(dòng)有關(guān)的反向重復(fù)序列里的FLP重組靶位FRT（FLPrecombinationtargets），形成反轉(zhuǎn)B(Rep1)、C(Rep2):保證質(zhì)粒穩(wěn)定、高拷貝在酵母中繁殖D:復(fù)制起始點(diǎn)3714-4312CDformA

B939-341A

BCformBDA整合型載體YIP5pBR322+酵母選擇標(biāo)記無(wú)酵母復(fù)制子，當(dāng)轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞時(shí)，只能利用其酵母標(biāo)記基因與染色體同源區(qū)重組后插入染色體中酵母載體的組成大腸桿菌質(zhì)粒：基本骨架DNA復(fù)制起始區(qū)：2μ的復(fù)制起始區(qū)及ARS選擇標(biāo)記

整合介導(dǎo)區(qū)

有絲分裂穩(wěn)定區(qū)：2μ的STB表達(dá)盒：?jiǎn)?dòng)子、中止、信號(hào)序列

酵母系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

YPDβ-glucanaseCa＋2

DNA細(xì)胞

1～2107cell/ml

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體再生

(A600=0.4)PEG4000

轉(zhuǎn)化子多為多倍體

感受態(tài)轉(zhuǎn)化(LiClorLiOAc)

YPD

TE0.3MLiOAc

DNA42C，5min細(xì)胞

1～2107cell/ml

細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化子

(A600=0.4)PEG4000，1h

鋰離子可能引起個(gè)別基因突變

電穿孔法酵母系統(tǒng)的選擇性標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記

LEU2,TRP1,URA3,HIS3顯性(dominant)選擇標(biāo)記氨基葡萄糖苷抗生素(G418)抗性，銅抗性CUP1自動(dòng)選擇(autoselection)

編碼酵母KillerToxin（致死毒素）基因和免疫基因，無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞被有質(zhì)粒細(xì)胞殺死，故可自動(dòng)選擇轉(zhuǎn)化子釀酒酵母宿主菌單倍體模式菌多倍體生產(chǎn)菌多倍體模式菌第六章酶工程與生物轉(zhuǎn)化基本概念重要的微生物生化反應(yīng)與酶生物轉(zhuǎn)化酶分子的改造固定化酶與固定化細(xì)胞酶工程

酶工程：酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用改善酶的生產(chǎn)產(chǎn)量工藝成本改善酶的性質(zhì)酶的活力底物特異性反應(yīng)條件酶的穩(wěn)定性化學(xué)酶工程與生物酶工程化學(xué)酶工程分離純化化學(xué)修飾固定化生物酶工程基因工程酶分子酶工程生物轉(zhuǎn)化酶的特點(diǎn)催化性：

催化效率為化學(xué)催化劑的107-1013倍

專一性：立體化學(xué)專一性：光學(xué)；幾何非立體化學(xué)專一性：鍵；基團(tuán)；絕對(duì)可調(diào)性酶的分類1.氧化還原酶類：促進(jìn)氧化還原反應(yīng)，如脫氫酶2.轉(zhuǎn)移酶類：使一個(gè)底物的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物分子，如轉(zhuǎn)氨酶3.水解酶類：使底物加水分解，如蛋白水解酶4.裂合酶類：使底物失去或加上某一部分，如羧化酶5.異構(gòu)酶類：使底物分子內(nèi)部排列改變，如變位酶；6.合成酶類：使兩個(gè)底物結(jié)合，如谷氨酰胺合成酶。酶的基本性質(zhì)酶活力米氏常數(shù)Km

V=V

maxS/(Km+S)最適溫度最適pH穩(wěn)定性（溫度、pH）底物專一性各種物質(zhì)的影響微生物是應(yīng)用酶的最重要來(lái)源微生物酶的特點(diǎn)：資源的豐富性來(lái)源的穩(wěn)定性生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性使用的便利性微生物的生化反應(yīng)水解與縮合：多糖寡糖單糖多肽寡肽氨基酸核酸核苷酸脂肪脂肪酸+甘油

CN+H2OCO-NH2氧化還原：

CHC-OHCHOCOOHCHOC-OH+COOHC=CCH-CH轉(zhuǎn)氨與脫氨：

C-OHC-NH2C=OC-NH2其他

重要的工業(yè)酶制劑α-淀粉酶：淀粉糊精，B.subtiiius,pH5~6,T~60°C葡萄糖淀粉酶：淀粉葡萄糖（外切非還原端

-1,4糖苷鍵），A.niger,pH4~5,T~60°C蛋白酶：肽鍵水解，蛋白質(zhì)

……

氨基酸堿性：pH10~11，皮革脫毛，加酶洗滌劑中性：食品加工，醫(yī)藥酸性：pH2~4，毛皮軟化，啤酒澄清，羊毛染色，飼料添加脂肪酶：催化酯化、轉(zhuǎn)酯、酯交換、對(duì)映體拆分在油、水界面反應(yīng)

生物柴油生物柴油動(dòng)、植物或微生物油脂通過(guò)酯交換制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料，為長(zhǎng)鏈脂肪酸的單烷基酯。脂肪酶油脂+短鏈醇→生物柴油+甘油其它重要糖苷酶?-淀粉酶纖維素酶

內(nèi)切β－葡聚糖苷酶(EC3.2.1.4)

纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)β－葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)木聚糖酶?-半乳糖苷酶葡萄糖異構(gòu)酶環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶淀粉制葡萄糖酸水解酶水解淀粉需精制不需精制投料濃度~25%~50%水解率90%>98%收率70%80%質(zhì)量有味苦、色深無(wú)苦味及色素設(shè)備耐酸不需耐酸環(huán)境污染友好時(shí)間~1小時(shí)24~48小時(shí)淀粉糖化過(guò)程

淀粉漿

α-淀粉酶液化液（DE12~18)

葡萄糖淀粉酶糖化液（DE95~96)

干燥、結(jié)晶DE：右旋糖當(dāng)量（dextrose

equivalent）

淀粉液化程度的判斷淀粉吸附碘分子的顯色反應(yīng)淀粉分子鏈

45403631129以下呈

色

藍(lán)色

藍(lán)紫色

紫紅色

紅色

淡紅色

碘液本色果葡糖漿

葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖果糖

甜度0.71.5~1.7

反應(yīng)溫度（°C）果糖（%）2542.54047.96053.57056.58058.5低聚糖雙歧因子抗齲齒糖苷酶多糖低聚糖（寡糖）飼料用酶補(bǔ)充幼齡禽畜的內(nèi)源酶：

α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶非淀粉多糖水解酶：纖維素酶、木聚糖酶、?-葡聚糖酶、果膠酶植酸酶：植物中60～80%的磷以植酸（肌醇六磷酸）鹽存在芳香族化合物的降解苯的生物降解苯鄰苯二酚降解取代苯的生物降解多環(huán)芳烴的生物降解手性化合物的生物拆分與生物合成關(guān)于手性的基本概念手性化合物：含不對(duì)稱碳原子具有光學(xué)活性的化合物手性拆分：外消旋體一種對(duì)映體手性合成：立體選擇性催化合成手性化合物手性生物拆分用酶：

水解酶、氧化還原酶、消旋酶手性生物合成用酶：水解酶、氧化還原酶、裂解酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、連接酶等輔酶與輔酶再生許多氧化還原反應(yīng)涉及輔酶等輔助因子

輔酶功能NAD+/NADP+轉(zhuǎn)移

FMN/FAD轉(zhuǎn)移

CoQ轉(zhuǎn)移

THFA轉(zhuǎn)一碳基團(tuán)

CoA轉(zhuǎn)酰、脂肪代謝磷酸吡哆醛轉(zhuǎn)氨、脫羧基、消旋硫胺素焦磷酸氧化、脫羧、醛基轉(zhuǎn)移鈷胺酰胺轉(zhuǎn)甲基生物素羧化NAD作為輔助因子與300個(gè)以上細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)NADH/NAD+影響一些基因的表達(dá)NADH/NAD+影響一些酶的活性酶分子的改造理性設(shè)計(jì)(rationaldesign)與非理性設(shè)計(jì)(irrationaldesign)酶的化學(xué)修飾定點(diǎn)突變易錯(cuò)PCR(errorpronePCR)DNAshuffling雙功能酶酶的化學(xué)修飾

對(duì)酶分子上的一些基團(tuán)進(jìn)行修飾，以改善酶的性質(zhì)（活性、穩(wěn)定性、免疫原性）可溶性大分子（PEG等）修飾表面活性劑修飾，提高有機(jī)溶劑中的溶解度用對(duì)特定氨基酸殘基作用的修飾劑與酶反應(yīng)，以確定酶的活性中心Ser---PMSFLys---PLPTrp---NBSHis---DEPCArg---PGOGlu/Asp---CCMT定點(diǎn)突變

葡萄糖異構(gòu)酶Gly138Pro138，最適溫度提高10-12C(可能由于Pro138替代Gly138引入的一個(gè)吡咯環(huán)剛好能夠填充Gly138附近的空洞,使突變蛋白的空間結(jié)構(gòu)更具剛性,從而提高了酶的熱穩(wěn)定性)。易錯(cuò)PCR(errorpronePCR)

在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)，通過(guò)向相應(yīng)編碼基因的DNA分子中隨機(jī)引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變,再經(jīng)篩選獲得所需的突變株。是一種相對(duì)簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的隨機(jī)突變方法。

改變dNTP的比例低保真度DNA聚合酶增加離子濃度基因大?。?/p>

800bp）突變頻率（1～5/基因）枯草桿菌蛋白酶：3點(diǎn)突變體活力提高38倍，10點(diǎn)突變體活力提高256倍DNAshuffling

靶基因隨機(jī)突變

DNase碎片化碎片間互為模板與引物，重組PCRPCR，篩選出理想的突變-內(nèi)酰胺酶：活力提高270倍雙功能酶E1E2ABPe1e2

海因酶-N-氨甲?；饷鸽p功能酶RHC－C=OHNNH海因酶

R－CH－COOHCNH－CONH2

OR－CH－COOHN-氨甲酰基水解酶R－CH－COOHNH－CONH2NH2

構(gòu)建雙功能酶，一步完成轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化以酶或酶系為催化劑進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程不需要細(xì)胞的生長(zhǎng)。生物轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)：條件溫和，反應(yīng)專一濃度較低生物轉(zhuǎn)化的應(yīng)用：化學(xué)合成難以實(shí)現(xiàn)的復(fù)雜反應(yīng)立體選擇性反應(yīng)綠色化學(xué)甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化1711161936

11-,11-,16-羥基化；1-2，4-5脫氫；3:OH=O；3、21位酯的水解；A環(huán)芳構(gòu)化；17位酮基的不對(duì)稱還原Merck公司：1270磅脫氧膽酸，30余步反應(yīng)合成938mg醋酸可的松，其中9步反應(yīng)用于11位羥基化生物轉(zhuǎn)化合成L-色氨酸

色氨酸合成酶絲氨酸+吲哚色氨酸除蟲菊酯丙烯菊酯（混旋）

S-丙烯菊酯生物活性提高245倍氨基酸的手性拆分

D－氨基酸氧化酶DL－苯丙氨酸L－苯丙氨酸＋苯丙酮酸生物轉(zhuǎn)化合成丙烯酰胺

腈水合酶丙烯腈丙烯酰胺生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇XRXyloseXylitolNAD(P)+XDHNAD(P)H

Xylulose固定化酶與固定化細(xì)胞在保持酶活性的前提下,借助物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定在特殊的載體上或限制于一定區(qū)域內(nèi)，使它和整體的相分隔開來(lái)而制成的生物催化劑。固定化的特點(diǎn)

催化劑可反復(fù)使用酶的穩(wěn)定性提高利于連續(xù)化生產(chǎn)后處理相對(duì)簡(jiǎn)單

活力損失底物限制（小分子、可溶）固定化方法吸附

物理吸附：氫鍵、疏水鍵活力損失小，易脫落離子吸附：離子鍵活力損失小，牢固，易受環(huán)境影響包埋

網(wǎng)格型：將酶包埋在凝膠或其他聚合體網(wǎng)格內(nèi)微囊型：將酶包埋在高分子半透膜內(nèi)交聯(lián)：利用有雙功能團(tuán)或多功能團(tuán)的試劑與酶分子之間進(jìn)行分子交聯(lián)

共價(jià)連接：將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合

空間限制第七章

微生物發(fā)酵微生物發(fā)酵基本概念生物質(zhì)的利用微生物發(fā)酵應(yīng)用舉例

發(fā)酵(fermentation)沒有空氣的生活（lifewithoutair）----巴斯德細(xì)胞在厭氧條件下代謝營(yíng)養(yǎng)物獲得能量的生化反應(yīng)微生物生長(zhǎng)并進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的過(guò)程發(fā)酵的目的獲得生物量：細(xì)胞獲得目的產(chǎn)物：蛋白質(zhì)（酶），代謝產(chǎn)物（初級(jí)、次級(jí)）發(fā)酵的基本流程和設(shè)備

保藏菌種

固體培養(yǎng)基

斜面試管、茄子瓶

搖瓶培養(yǎng)基

搖瓶（1~2級(jí)）搖床、三角瓶

種子培養(yǎng)基

種子發(fā)酵（1級(jí)或多級(jí)）發(fā)酵罐

發(fā)酵培養(yǎng)基

主發(fā)酵發(fā)酵罐

后處理產(chǎn)品無(wú)菌操作接種間輻射滅菌化學(xué)滅菌空氣過(guò)濾發(fā)酵罐高壓蒸汽滅菌通氣系統(tǒng)過(guò)濾滅菌TC

發(fā)酵溫度

thr連續(xù)滅菌間歇滅菌發(fā)酵過(guò)程的噬菌體問(wèn)題現(xiàn)象：發(fā)酵不正常，產(chǎn)量、糖耗、pH、粘度、泡沫等鏡檢：溶菌現(xiàn)象防治：定期檢查設(shè)備、管道管件、過(guò)濾器等環(huán)境藥物：鰲合劑、抗生素菌株：抗性菌株、菌株輪換發(fā)酵過(guò)程的控制發(fā)酵過(guò)程控制的主要參數(shù)溫度pH營(yíng)養(yǎng)溶氧通氣量攪拌速度壓力發(fā)酵過(guò)程控制存在的問(wèn)題非線性時(shí)變性響應(yīng)滯后傳感器少發(fā)酵過(guò)程的泡沫降低了發(fā)酵罐的裝料系數(shù)“逃液”造成損失并增加了污染機(jī)會(huì)影響通氣、攪拌，妨礙氧溶解，造成代謝異常妨礙CO2的排出，不利正常代謝化學(xué)消泡機(jī)械消泡發(fā)酵類型I:產(chǎn)物是初級(jí)能量代謝的結(jié)果，一般是糖的直接氧化產(chǎn)物。

A

PorA

B

C

P

例：乙醇發(fā)酵、乳酸發(fā)酵II:產(chǎn)物通過(guò)能量代謝的間接途徑得到。

A

B

C

DE

P

例：檸檬酸發(fā)酵、氨基酸發(fā)酵III:產(chǎn)物不是初級(jí)代謝形成的，與微生物細(xì)胞的物質(zhì)代謝無(wú)關(guān)。例：抗生素發(fā)酵發(fā)酵方式批式(batch)發(fā)酵：整個(gè)過(guò)程中除了空氣進(jìn)入和尾氣排出，與外界沒有物料交換補(bǔ)料流加(fedbatch)發(fā)酵：在分批發(fā)酵過(guò)程中間歇或連續(xù)地補(bǔ)加一種或數(shù)種營(yíng)養(yǎng)物

連續(xù)(continuous)發(fā)酵：連續(xù)或定時(shí)地以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)供給新的培養(yǎng)基，同時(shí)從發(fā)酵罐內(nèi)以相同的速度等量排出發(fā)酵液，酵罐內(nèi)液量恒定，微生物在恒定狀態(tài)下繁殖和代謝批式發(fā)酵的產(chǎn)物形成生長(zhǎng)結(jié)合型(growthassociated)：產(chǎn)物形成與生長(zhǎng)的限制因子相同

dp/dt=Kpdx/dt=Kpx

非生長(zhǎng)結(jié)合型(growthunassociated)

：產(chǎn)物形成速度取決于微生物濃度

dp/dt=Kpx

產(chǎn)物形成速度由與比生長(zhǎng)速度無(wú)關(guān)的其它因素決定，不能用動(dòng)力學(xué)方程描述，但可對(duì)具體的發(fā)酵過(guò)程簡(jiǎn)化一些條件后建立數(shù)學(xué)方程產(chǎn)乳酸發(fā)酵：

dp/dt=

dx/dt+x(、是pH的函數(shù))連續(xù)發(fā)酵的稀釋率f2s2

Vf1s1D=f/VD:稀釋率f:流量s:底物濃度V:體積

=dx/xdt營(yíng)養(yǎng)充分時(shí)：

=

maxS/(K+S)(Monod方程)如微生物不生長(zhǎng)，流出速度:-dx/dt=Dx發(fā)酵時(shí)：dx/dt=x–Dx平衡時(shí)：dx/dt=0，即：=D代入Monod方程，連續(xù)發(fā)酵時(shí)平衡稀釋率：

D=maxS/(K+S)發(fā)酵的后處理后處理在發(fā)酵工業(yè)中的地位：普通發(fā)酵產(chǎn)品，后處理成本>60%

基因工程發(fā)酵產(chǎn)品，后處理成本>80～90%后處理的一般流程：發(fā)酵液分離細(xì)胞濃縮粗分離精分離制成品后處理工藝的設(shè)計(jì)原則：產(chǎn)品的性質(zhì)產(chǎn)品的要求經(jīng)濟(jì)環(huán)保穩(wěn)定細(xì)胞的分離與破碎

細(xì)胞的分離過(guò)濾（壓濾、抽濾、膜分離）沉降（重力、離心）絮凝細(xì)胞的破碎物理（超聲、機(jī)械）化學(xué)生物膜分離微濾（

0.1-10）超濾（MW1000-100000）反滲（MW<1000

）濃差極化固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵：微生物在沒有或很少游離水的潮濕固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)與代謝的過(guò)程特點(diǎn)：投資少、能耗低、原料廉價(jià)傳熱傳質(zhì)差、效率低應(yīng)用：生物農(nóng)藥、飼料、粗酶、食品等發(fā)酵條件的優(yōu)化確定優(yōu)化目標(biāo)

TSP+B+s產(chǎn)量、產(chǎn)率、發(fā)酵單位(titer):P(g/L)產(chǎn)率、轉(zhuǎn)化率(yield):P/(S–s)(%,g/g)生產(chǎn)強(qiáng)度、產(chǎn)率(productivity):P/T(g/L.h)其他確定影響因素種子：種齡、接種量

培養(yǎng)基：組分、pH、滅菌條件

環(huán)境：溫度、pH、通氣、攪拌、壓力、設(shè)備

發(fā)酵條件優(yōu)化的方法單因子法正交法響應(yīng)面法生物質(zhì)的利用農(nóng)產(chǎn)品廢棄物的組分木質(zhì)纖維素的糖化木質(zhì)纖維素的預(yù)處理生物質(zhì)利用存在的問(wèn)題生物質(zhì)是地球上最大量的可再生資源生物質(zhì)：利用大氣、水、土地等通過(guò)光合作用而產(chǎn)生的各種有機(jī)體。農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中除糧食、果實(shí)以外的木質(zhì)纖維素等物質(zhì)。我國(guó)每年產(chǎn)生7億噸秸稈主要農(nóng)產(chǎn)品廢棄物的組分

玉米秸桿麥秸稻草糖（％糖當(dāng)量）

C6葡萄糖39.036.641.0

甘露糖0.30.81.8

半乳糖0.82.40.4

C5木糖14.819.214.8

阿拉伯糖3.22.44.5

非糖類物質(zhì)（％）

木質(zhì)素15.114.59.9

灰分4.39.612.4

蛋白質(zhì)4.03.0

—木質(zhì)纖維素糖化的方法

酶法

纖維素酶纖維素

葡萄糖

木聚糖酶半纖維素

木糖酸法稀酸濃酸農(nóng)產(chǎn)品廢棄物的預(yù)處理機(jī)械破碎用切碎、研磨等方法將木質(zhì)纖維素材料破碎

熱裂解

300oC以上高溫使纖維素分解為氣體和木炭汽爆高壓飽和蒸汽（160oC-260oC）處理后急劇降壓，使木質(zhì)纖維素爆裂氨爆木質(zhì)纖維素在高溫、高壓下與氨水接觸后急劇減壓爆裂碳爆木質(zhì)纖維素經(jīng)二氧化碳處理后爆裂酸水解硫酸、鹽酸等強(qiáng)酸處理堿水解

NaOH等堿處理木質(zhì)纖維素?zé)崴饪刂苝H條件下用190oC熱水處理氧化過(guò)氧化氫處理材料，氧化除去部分木質(zhì)素和半纖維素臭氧臭氧氧化除去部分木質(zhì)素和半纖維素有機(jī)溶劑加有機(jī)溶劑在高溫或酸催化下破壞木質(zhì)素微生物處理用產(chǎn)過(guò)氧化物酶的白腐菌等微生物降解木質(zhì)素

農(nóng)產(chǎn)品廢棄物利用存在的問(wèn)題環(huán)境問(wèn)題經(jīng)濟(jì)性問(wèn)題技術(shù)問(wèn)題微生物發(fā)酵舉例制造微生物生物量PHB發(fā)酵黃原膠發(fā)酵二元酸發(fā)酵丙酮酸發(fā)酵乙醇發(fā)酵Vc發(fā)酵制造微生物生物量單細(xì)胞蛋白假絲酵母(Candidasp.)等面包酵母釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)微生物肥料根瘤菌(Rizobiumsp.)微生物農(nóng)藥蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)三次采油解烴棒桿菌(C.hydrocarboclastus)等環(huán)境治理芽孢桿菌(Bacillussp.)等卡介苗無(wú)毒結(jié)核分枝菌(Mycobacteriumtuberculosis)PHB發(fā)酵

(glycolysis)Glucose→pyruvate→acetyl-CoA→TCA↓↓3-ketothiolaseacetateacetoacetyl-CoA↓reductaseR-(-)-3-hydroxybutyryl-CoA↓PHAsynthesis

氮源限制

PHB黃原膠發(fā)酵野油菜黃單胞菌（Xanthomonascampestris）產(chǎn)生的胞外多糖，發(fā)酵液粘度可達(dá)7000cp非牛頓型發(fā)酵剪切稀化二元酸發(fā)酵CH3(CH2)nCH3

↓↓β-oxidationCH3(CH2)nCOOH→→CH3(CH2)n-2COOH↓↓ω-oxidationHOOC(CH2)nCOOH水、油、氣、固多相反應(yīng)β-氧化與ω-氧化丙酮酸發(fā)酵Glu

LatPyrEtOH

TCA營(yíng)養(yǎng)（維生素、氨基酸）限制溶氧控制乙醇發(fā)酵產(chǎn)物抑制問(wèn)題原料成本問(wèn)題Vc二步法發(fā)酵

弱氧化醋桿菌“大、小”菌混合山梨醇山梨糖2-酮基-L-古龍酸間苯三酚發(fā)酵大腸桿菌工程菌：0.8g/L條件優(yōu)化：4g/L發(fā)酵/萃取耦合：17g/L分段－發(fā)酵/萃取耦合：50g/L第八章微生物代謝工程代謝工程代謝網(wǎng)絡(luò)代謝流分析應(yīng)用舉例代謝工程

代謝工程是基因工程的一個(gè)重要分支。利用重組DNA為主的技術(shù)操縱酶的活性以改變細(xì)胞調(diào)節(jié)功能、定向改造細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)、重新設(shè)計(jì)細(xì)胞的代謝系統(tǒng)，達(dá)到改變生物體內(nèi)代謝流，擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的代謝途徑和目的。微生物代謝工程可大幅度提高微生物的應(yīng)用價(jià)值。代謝工程誕生的條件重組DNA技術(shù)在應(yīng)用微生物系統(tǒng)的建立代謝網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)數(shù)學(xué)工具一些應(yīng)用微生物的基因轉(zhuǎn)移AgrobacteriuntumefaciensCAzotobactervinelandiiCErwiniacarotovoyaCE.coliCHaemophilusinfluenzaeCSalmonellatyphimuriumCStaphylococcusaureusCStreptococcuslactisPStreptococcuspneumoniaeCBccillussubtilisP,CBccillusthuringiensisPClostridiunacetobutylicumPCorynebacteriumglutamicumPStreptomycesspPSaccharomycescerevisiaeP,C代謝網(wǎng)絡(luò)代謝網(wǎng)絡(luò)：分解代謝途徑、合成代謝途徑和膜輸送體系的有序組合。代謝網(wǎng)絡(luò)的組成：

(1)中心代謝途徑

(2)收斂途徑：指向中心代謝途徑，并以中心代謝途徑中間化合物為接口的途徑

(3)發(fā)散途徑：以中心代謝途徑的中間化合物為起點(diǎn)，從中心代謝途徑發(fā)散的途徑在一定范圍內(nèi)可對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行人為的修飾，從而實(shí)現(xiàn)代謝途徑(網(wǎng)絡(luò))的延伸和剪接。網(wǎng)絡(luò)剛性

微生物經(jīng)初級(jí)代謝途徑提供細(xì)胞生長(zhǎng)和維持所必需的前體和能量。作為自然界長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，微生物細(xì)胞具有在代謝網(wǎng)絡(luò)某些分支處對(duì)抗碳架物質(zhì)流量改變的調(diào)節(jié)機(jī)制，使這種流量分布不會(huì)因某終端產(chǎn)物對(duì)其合成途徑的反饋調(diào)節(jié)的解除而發(fā)生重大的調(diào)整。生物體這種固有的對(duì)流量改變的抵抗能力稱為代謝或網(wǎng)絡(luò)的剛性。載流途徑與節(jié)點(diǎn)載流途徑：代謝網(wǎng)絡(luò)中一部分首尾相連形成的一條從原料化合物到目的產(chǎn)物的途徑。包括原料化合物(碳架物質(zhì))胞外降解和進(jìn)入細(xì)胞、碳架物質(zhì)經(jīng)胞內(nèi)進(jìn)一步降解或轉(zhuǎn)化進(jìn)入中心代謝途徑、中心代謝途徑的一部分、目的產(chǎn)物合成途徑、目的產(chǎn)物排出細(xì)胞等五部分。節(jié)點(diǎn)：載流途徑兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)的交匯或分流處。碳架物質(zhì)流量在這里可發(fā)生變化，從而影響目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。主要節(jié)點(diǎn)

在產(chǎn)物形成時(shí)碳架物資流量分配發(fā)生明顯改變的節(jié)點(diǎn)。主要節(jié)點(diǎn)在一定條件下可發(fā)生改變

GG

G6PRibu5PG6PRibu5P

F6PF6P

一般lys>60%節(jié)點(diǎn)的剛性節(jié)點(diǎn)的剛性：節(jié)點(diǎn)下游分支對(duì)于代謝改變的抗性