中藥化學成分提取分離方法-中國中醫(yī)科學院中藥所 邊寶林

中藥化學成分提取分離方法

中國中醫(yī)科學院中藥所

邊寶林日本學者：（長井長義）天然藥物化學研究定義：1、將藥品（生藥）改變成為利于人體吸收的形式。2、對有效成分不明的草根、樹皮進行分析，明確有效成分。3、通過成分的改造、合成、創(chuàng)造新藥。中藥有效成分的研究基于以上內容，突出中醫(yī)用藥理論，繼承、發(fā)揚中醫(yī)藥寶庫，造福人類。1、已有數千年的用藥史（經驗和理論）2、飲片用藥的特點揭示中藥有效性的物質基礎

Salicin（柳の皮）Khellin、Ammi、visnaga（セリ科）解熱冠脈擴張作用

morphine鎮(zhèn)痛劑ergotamine麥角アルヵロィド中藥化學成分提取分離方法常用化學成分提取分離方法大孔吸附樹脂分離有效成分的應用分離實例一、有效成分的提?、迦軇┨崛》á嫠魵庹麴s法㈢升華法㈣超臨界流體萃取法㈤其他方法㈠溶劑提取法溶劑提取法系選擇適當溶劑將中草藥中的化學成分從藥材中提取出來。遵循“相似相溶”規(guī)律。天然藥物中的化學成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質有關。溶劑可分為水、親水性有機溶劑和親脂性有機溶劑。一些常見溶劑的脂性的強弱順序如下：

石油醚>苯>氯仿>乙醚>乙酸乙酯>丙酮>乙醇>甲醇>水天然藥物化學成分可通過結構估計它們的極性。㈠溶劑提取法甙類的分子中結合有糖分子，羥基數目多，能表現(xiàn)強親水性，而甙元則屬于親脂性化合物，而生物堿鹽，能夠離子化，加大了極性，就變成了親水性化合物。鞣質是多羥基衍生物，列為親水性化合物。油脂、揮發(fā)油、蠟、脂溶性色素都是強親脂性成分。萜類、甾體等脂環(huán)類及芳香類化合物因為極性較小，易溶于氯仿、乙醚等親脂性溶劑中；糖苷、氨基酸等成分極性較大，易溶于水及含水醇中；酸性、堿性及兩性化合物，因為存在狀態(tài)（分子或離子形式）隨溶液而異，故溶解度將隨pH而改變。㈡水蒸氣蒸餾法水蒸氣蒸餾法只適用于具有揮發(fā)性、能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞，與水不發(fā)生反應，且難溶或不溶于水的成分的提取。天然藥物中的揮發(fā)油、某些小分子生物堿如麻黃堿、煙堿、檳榔堿以及某些小分子的酚性物質如牡丹酚等的提取可采用水蒸氣蒸餾法。㈢升華法某些固體物質如水楊酸、苯甲酸、樟腦等受熱在低于其熔點的溫度下，不經過熔化就可直接轉化為蒸氣，蒸氣遇冷后又凝結成固體稱為升華。天然藥物中有一些成分具有升華性質，能利用升華法直接中藥材中提取出來。但天然藥物成分一般可升華的很少。

㈣超臨界流體萃取法超臨界萃取法是一種集提取和分離于一體，又基本上不用有機溶劑的新技術。超臨界流體是處于臨界溫度（Tc）和臨界壓力（Pc）以上，介于氣體和液體之間的流體。這種流體同時具有液體和氣體的雙重特性?？梢宰鳛槌R界流體的物質：CO2、NH3、C2H6、CCL2F2、C7H16等，實際應用CO2較多。㈣超臨界流體萃取法CO2超臨界流體對物質溶解作用有一定選擇性，主要與物質的極性、沸點、分子量相關密切。極性較低的化合物易萃取，化合物極性基團多，萃取較難。對此，近年來采用再超臨界流體萃取中加入夾帶劑的方法。夾帶劑是在被萃取溶質和超臨界流體組成的二元系統(tǒng)中加入的第三組分，從而改善原來溶質的溶解度。常用的夾帶劑：甲醇、乙醇、丙酮等㈣超臨界流體萃取法超臨界流體萃取中藥成分的主要優(yōu)點：⑴可以在接近室溫下進行工作，防止某些對熱不穩(wěn)定的成分被破壞或逸散。如：通過對丹參超臨界萃取物的高效液相色譜法分析表明，丹參酮ⅡA含量為43.55%，以丹參酮為3.29%，丹參酮Ⅰ為7.60%，與普通方法相比總丹參酮類成分得到較好富集；再有人對丹參中活性成分的超臨界二氧化碳萃取工藝進行研究，現(xiàn)已第1夾帶劑進行萃取得丹參酮類活性部位，再用第2夾帶劑繼續(xù)萃取，得丹參素和原兒茶醛等酚酸類有效成分。⑵萃取過程中幾乎不用有機溶劑，萃取物中無有機物溶劑殘留，對環(huán)境無公害⑶提取效率高，節(jié)約能耗等㈤其他方法組織破碎法某些對熱不穩(wěn)定成分又可溶于水時，可用組織破碎提取法壓榨法某些成分在新鮮原料中含量較高或新鮮原料富含肉質可用壓榨法微波提取法二、有效成分的分離與精制化學成分分離精制常用方法原理㈠根據物質溶解度差別進行分離

㈡根據物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離

（逆流色譜技術）㈢根據物質的吸附性差別進行分離

（ODS與大孔吸附樹脂技術）㈣根據物質分子大小差異進行分離

（膜分離與凝膠技術）㈠根據物質溶解度差別進行分離

1、利用溫度不同引起溶解度的改變2、改變混合溶劑的極性3、調節(jié)溶液的pH值，改變分子的存在狀態(tài)4、沉淀法

5、鹽析法

㈡根據物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離分配系數（K）兩種相互不能任意混溶的溶劑（如氯仿與水）如置分液漏斗中充分振搖，放置后即可分成兩相。此時如果其中含有溶質，則溶質在兩相溶劑中的分配比（K）在一定溫度及壓力下為一常數，可以下式表示：K=CU/CLK：分配系數；CU：溶質在上相溶劑中的濃度；CL：溶質在下相溶劑中的濃度。㈡根據物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離1、液-液萃取法2、逆流連續(xù)萃取法3、逆流分配法（CounterCurrentDistribution，CCD）

4、液滴逆流色譜法（DCCC）5、高速逆流色譜法（HSCCC）6、氣液分配色譜（GC或GLC）7、液-液分配色譜（LC或LLC）1、液-液萃取法利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數的不同而達到分離的方法。萃取時如果各成分的分配系數相差越大，分離效率越高。水提取液中的有效成分是親脂性的物質，一般多用親脂性有機溶劑，如苯、氯仿或乙醚進行兩相萃?。挥行С煞质瞧谟H水性的物質，需用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、丁醇等。提取黃酮類成分多用乙酸乙脂和水的兩相萃取。提取親水性強的皂甙則多選用正丁醇、異戊醇和水作兩相萃取。2、高速逆流色譜

(High-speedCountercurrentChromatography，HSCCC)大多數色譜法都需要有固相載體某種形式的選擇性吸附作用。在應用固相載體色譜分離中，往往會存在不同程度的不可逆吸附，造成被分離樣品的損失，尤其在分離微量樣品時受到限制。高速逆流色譜，是近十年迅速發(fā)展起來的新型液—液分配色譜技術。與其它液相色譜分離方法相比．它不使用固相載體作固定相，被分離物質在互不相溶兩相分配分離，克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染、峰形拖尾等缺點。且花費溶劑少，分辨率高，可進行純品制備。利用HSCCC，中草藥粗提物的分離純化制備可同步完成，被分離物可定量回收。

HSCCC的應用

1.HSCCC的分離效率與氣相色譜和高效液相色譜等技術相比較，前者不適宜用它完成組成復雜的混合物的全譜分離分析。而其對于樣品的預處理條件較放松及回收率高，制備量大，特別適用于特定部位和特定組分的分離純化與制備。

HSCCC的應用2.制備中藥化學對照品3.中草藥化學對照品應具有高度均勻性，量值準確性和良好穩(wěn)定性，其純度要求很高。制備型HPLC曾是國外常用的主要手段。但是其設備和載體填料價格很高．對樣品前期處理要求嚴格，存在不可逆吸附，溶劑用量大的缺點。因此致力于HSCCC分離、統(tǒng)化、制備中草藥有效成分對照品的研究和產業(yè)化，具有現(xiàn)實意義。3、高效液相色譜(HPLC)

中藥的成分非常復雜，以往常用的薄層色譜等方法因其精密度、準確度、靈敏度、重現(xiàn)性差而不能滿足中藥現(xiàn)代化發(fā)展的需要。高效液相色譜正是以其穩(wěn)定、可靠、高效的特點成為中藥研究的最重要的分析方法。中藥質量的控制、天然藥物化學成分的分離及分析測定等。3、高效液相色譜(HPLC)檢測器是液相色譜的三大關鍵部件（高壓輸液泵、高效色譜柱和檢測器）之一。其發(fā)展在某種意義上決定著HPLC技術的進步。理想的檢測器應具有以下特點：⑴靈敏度高；⑵對溫度變化和流量波動不敏感；⑶死體積小，不使峰額外地擴展；⑷對溶劑無響應，能用于梯度洗脫操作⑸線性范圍寬；⑹對所有樣品都有響應；⑺對樣品無破壞性。常用的HPLC檢測器（1）紫外-可見分光檢測器（2）示差折光檢測器（3）二極管陣列檢測器（4）蒸發(fā)光檢測器（5）質譜檢測器（6）C、H核磁檢測器高效液相色譜的應用中藥化學成分分析成分分離制備(1)特別適用于極性較大的成分(如皂苷類)分離；(2)先以分析色譜摸索分離條件；(3)樣品一定要用流動相溶解，再以濾膜過濾。㈢根據物質的吸附性差別進行分離在天然有機化合物分離及精制工作中，吸附現(xiàn)象利用得十分廣泛。其中又以固-液吸附用得最多，其分：物理吸附(表面吸附，physicaladsorption)：以硅膠、氧化鋁及活性炭為吸附劑化學吸附（chemicaladsorption）半化學吸附（semichemicaladsorption）：聚酰胺層析1、物理吸附液-固物理吸附色譜是運用較多的一種方法，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分。一般不適用于高分子量樣品如蛋白質、多糖或離子型親水性化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質這三個因素。⑴吸附劑①硅膠②氧化鋁

活性炭吸附劑的特點硅膠和氧化鋁為極性吸附劑，有以下特點：①對極性物質具有較強的親和能力。故同為溶質，極性強者將被優(yōu)先吸附。②溶劑極性越弱，則吸附劑對溶質將表現(xiàn)出越強的吸附能力。溶劑極性增強，則吸附劑對溶質的吸附能力即隨之減弱。③溶質即使被硅膠、氧化鋁吸附，但一旦加入極性較強的溶劑時，又可被后者置換洗脫下來。

吸附劑的特點活性炭因為是非極性吸附劑，故與硅膠、氧化鋁相反，對非極性物質具有較強的親和能力，在水中對該類物質表現(xiàn)出強的吸附能力。溶劑極性降低，則活性炭對該類物質的吸附能力也隨之降低。故從活性炭上洗脫被吸附物質時，洗脫溶劑的洗脫能力將隨溶劑極性的減弱而增強。⑵溶劑洗脫劑的選擇，須根據被分離物質與所選用的吸附劑性質這兩者結合起來加以考慮。在用極性吸附劑進行層析時，當被分離物質為弱極性物質，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質為強極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應降低。⑶被分離物質的性質被分離的物質與吸附劑，洗脫劑共同構成吸附層析中的三個要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個成分的分離情況，直接與被分離物質的結構與性質有關。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附性強。2、吸附薄層色譜薄層層析是一種簡便、快速、微量的層析方法。一般將吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進行層析時，即稱薄層層析。（硅膠、聚酰胺等）針對某些性質特殊的化合物的分離與檢出，有時需采用一些特殊薄層。特殊薄層

①熒光薄層②絡合薄層③酸堿薄層和PH緩沖薄層

薄層層析法應用①化學成分的預試②化學成分的鑒定③探索柱層分離的條件3、吸附柱色譜（柱層析）⑴吸附劑的用量

一般為樣品量的30～60倍。樣品極性較小、難以分離者，吸附劑用量可適當提高到樣品量的100～200倍。據此可選擇適當規(guī)格的色譜管，實驗室中常用色譜管的規(guī)格如下所示，其高度與直徑比（h/d）約為（15∶1）～（20：1）。柱色譜用的硅膠及氧化鋁通常以100～200目或200～300目為宜，或甚至直接采用薄層色譜用規(guī)格，其分離效果可以大大提高。3、吸附柱色譜⑵洗脫劑的選擇，以TLC摸索洗脫條件裝柱，濕法裝柱（以起始洗脫劑拌勻裝柱）或干法裝柱。3、吸附柱色譜（3）樣品的預處理能直接溶于洗脫劑的樣品用適量洗脫劑溶解樣品，盡可能少，以利樣品在吸附劑柱上形成狹窄的原始譜帶。不能溶解于洗脫劑的樣品，則將用能使之溶解的溶劑溶解后，再用少量吸附劑拌勻，并減壓抽干溶劑或在60℃下加熱揮盡溶劑，置真空干燥器中減壓干燥或直接減壓抽干、研粉后再小心鋪在吸附劑柱上。3、吸附柱色譜（4）洗脫用溶劑的極性宜逐步增加，跳躍不能太大。實踐中多用混合溶劑，并通過巧妙調節(jié)比例以改變極性，達到梯度洗脫分離物質的目的。一般混合溶劑中強極性溶劑的影響比較突出，故不可隨意將極性差別很大的兩種溶劑組合在一起使用。3、吸附柱色譜（5）為避免發(fā)生化學吸附，酸性物質宜用硅膠、堿性物質則宜用氧化鋁進行分離。硅膠、氧化鋁用適當方法處理成中性時，情況會有所緩解。通常在分離酸性