新項(xiàng)目方法能力驗(yàn)證報(bào)告(水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法)

XXXX工程方法驗(yàn)證力氣驗(yàn)證報(bào)告日期：

水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法HJ347.2-2023報(bào)告編號(hào)：第報(bào)告編號(hào)：第17頁(yè)水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法HJ347.2-2023方法驗(yàn)證力氣驗(yàn)證報(bào)告1、方法依據(jù)及適用范圍HJ347.2-2023制定。該方法的適用范圍：地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測(cè)定。2、定義菌群在培育基中生長(zhǎng)生殖分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，產(chǎn)生的酸使溴甲酚紫指示44.5℃復(fù)發(fā)酵培育，培育基中的膽鹽三號(hào)可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，最終產(chǎn)氣的細(xì)菌確定為MPN表，得出糞大腸菌群濃度值。3、主要儀器、設(shè)備及試劑培育基與試劑4.1.1乳糖蛋白胨培育液蛋白胨10g乳糖5g牛肉膏3g氯化鈉5g蒸餾水1000mL溴甲酚紫乙醇溶液〔ρ=16g/L〕1mL1000mL蒸餾水7.41mL溴甲酚紫乙醇溶液〔p=16g/L〕，充分混勻，分裝于裝有倒管的試管中，置高壓蒸汽滅菌器中，以115℃滅菌20min，貯于冷暗處。4.1.2EC培育基胰胨20g乳糖5g膽鹽三號(hào)1.5g〔K2HPO4〕4g〔KH2PO4〕1.5g氯化鈉5g蒸餾水1000mL將上述成分加熱溶解，然后分裝于含有玻璃倒管的試管中。置高壓蒸汽滅菌器中，115℃20min，滅菌后pH6.9。無(wú)菌水℃取適量試驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。2 2 3 硫代硫酸鈉〔NaSO5HO2 2 3 乙二胺四乙酸二鈉〔C H NONa.2H

10 14 2 8 2 22 2 硫代硫酸鈉溶液℃ρ〔NaSO〕=0.102 2 稱取15.7g100ml，臨用現(xiàn)配。乙二胺四乙酸二鈉溶液℃ρ〔C

H NONa.2H

O〕=0.15g/ml10 14 2 8 2 215g100ml，此溶液30d。3.1儀器恒溫恒濕培育箱。0.001g。過(guò)濾裝置。pH計(jì)。培育皿。高壓滅菌鍋。300mL、50mL、20mL。4、分析過(guò)程試驗(yàn)步驟15管法55ml三倍乳糖蛋白胨培育基〔內(nèi)有倒管〕，按無(wú)菌操作要求各參與樣品10ml，在5支裝有已10ml單倍乳糖蛋白胨培育基的試管中〔內(nèi)有倒管〕，按無(wú)菌操作要1ml510ml單倍乳糖蛋白胨培育基的試管中〔內(nèi)有倒管〕，按無(wú)菌操作要求各參與樣品0.1ml。對(duì)于受到污染的樣品，先將樣品稀釋后再依據(jù)上述操作接種，以生活污水為例，先將樣品稀10410ml、1ml0.1ml。當(dāng)樣品接1ml時(shí)，應(yīng)將樣品制成稀釋樣品后使用。按無(wú)菌操作要求方式吸10ml90ml1:101:1010ml90ml無(wú)菌水的三角燒瓶中，1:1004-1。接種量〔ml〕樣品類型1010.110－2接種量〔ml〕樣品類型1010.110－210－310－410－5水源水▲▲▲地表水湖泊〔水庫(kù)〕▲▲▲河流▲▲▲生活污水▲▲▲廢水處理前▲▲▲工業(yè)廢水處理后▲▲▲地下水▲▲▲12管法250ml三倍乳糖蛋白胨培育基的大試管中〔內(nèi)有倒管〕，100ml10支裝5ml三倍乳糖蛋白胨培育基的試管中〔內(nèi)有倒管〕，按無(wú)菌操10ml。初發(fā)酵試驗(yàn)將接種后的試管，在37℃±0.5℃下培育24h±2h。發(fā)酵試管顏色變黃為產(chǎn)酸，小玻璃倒管內(nèi)有氣泡為產(chǎn)氣。產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的試管說(shuō)明試驗(yàn)陽(yáng)性。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽(yáng)性。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)略微振蕩在初發(fā)酵試驗(yàn)中顯示為陽(yáng)性或疑似陽(yáng)性〔只產(chǎn)酸未產(chǎn)氣〕的EC培育基的試管中。在44.5℃±0.5℃24h±2h。轉(zhuǎn)接后全部試管必需在30min內(nèi)放進(jìn)恒溫培育箱或水浴鍋中。培育后馬上觀看，倒管中產(chǎn)氣證明為糞大腸菌群陽(yáng)性。空白試驗(yàn)每次試驗(yàn)都要用無(wú)菌水〔6.4〕依據(jù)以上步驟進(jìn)展試驗(yàn)室空白測(cè)定。陽(yáng)性及陰性比照株〔Enterobacteraerogenes〕制成濃度為300～3000MPN/L的菌懸液，分別取相應(yīng)體積的菌懸液按接種的要求接種于試管中，然后按初發(fā)酵試驗(yàn)和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)要求培育，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反響，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反響，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明緣由后重測(cè)定。結(jié)果計(jì)算與表示結(jié)果計(jì)算樣品中糞大腸菌群數(shù)〔CFU/L〕，按公式〔1〕進(jìn)展計(jì)算：MPNMPN值×100C= 〔1〕fC——樣品中糞大腸菌群數(shù)，CFU/L；fMPN值——100mL樣品中糞大腸菌群數(shù)，MPN/100mL；100——10×10ml，其中，10MPNMPN/100mlMPN/L，10mlMPN表中最大接種量；f—樣品接種量，ml結(jié)果表示測(cè)定結(jié)果保存至整位數(shù)，最多保存兩位有效數(shù)字，當(dāng)測(cè)定結(jié)果 CFU/L時(shí)以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示當(dāng)測(cè)定結(jié)果低于檢出限時(shí)，12管法以“未檢出”或“＜3MPN/L”表示；15管法以“未檢出”或“＜20MPN/L”表示。5、方法力氣驗(yàn)證方法檢出限以清潔水代替樣品，按無(wú)菌操作要求分別取樣品100ml、500ml過(guò)濾后77次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差等。表5-1 15管法方法檢出限測(cè)試數(shù)據(jù)表平行編號(hào)MPN/100mlMPN/L測(cè)定結(jié)果1#2#3#4#5#平行編號(hào)MPN/100mlMPN/L測(cè)定結(jié)果1#2#3#4#5#6#7#平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差〔SD〕t值檢出限平行編號(hào)MPN/100mlMPN/L測(cè)定結(jié)果1#2#3#4#5#6#7#平均值///////標(biāo)準(zhǔn)偏差〔SD〕t值檢出限方法周密度36次進(jìn)展周密度試驗(yàn)，方法周密5-3平行樣品編號(hào)123平行樣品編號(hào)123測(cè)定結(jié)果1次2次3次4次5次6次xi〔MPN/L〕標(biāo)準(zhǔn)偏差S相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD〔%〕6、結(jié)論人員培訓(xùn)、設(shè)施和環(huán)境在進(jìn)展方法驗(yàn)證前已對(duì)相關(guān)技術(shù)人員進(jìn)展了技術(shù)力氣培訓(xùn)，同時(shí)設(shè)施和環(huán)境條件等均滿足方法要求。方法檢出限驗(yàn)證7次計(jì)算方法檢出限，滿足方法關(guān)于質(zhì)量把握的要求。方法周密度驗(yàn)證不同含量的實(shí)際樣品分別平行測(cè)定6次進(jìn)展周密度試驗(yàn)。實(shí)際樣品6次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差滿足方法關(guān)于質(zhì)量把握的要求。通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，本試驗(yàn)的人員培訓(xùn)和技術(shù)力氣、設(shè)施和環(huán)境條件器設(shè)備、試劑材料、方法性能指標(biāo)〔檢出限、周密度、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差〕能滿足方法特性