大鼠在體腸吸收動力學研究

大鼠在體腸吸收動力學研究

山奈酚是一種可從姜科植物山奈根莖、山奈刺的山奈提取物中提取的黃酮醇，以及從姜屬植物的優(yōu)勢物質中提取的原始黃酮醇。它也是銀杏和沙棘等植物有效部位中最重要的黃酮醇之一。藥理研究表明,它可抑制金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌和痢疾桿菌的生長;對眼醛糖還原酶有抑制作用;能止咳祛痰;利尿。本實驗采用大鼠在體腸吸收實驗模型,考察山奈酚的吸收特性,為山奈酚及其類似物的開發(fā)提供生物藥劑學信息。1材料和方法1.1儀器、試劑和儀器LaballianceSeriesⅢ型等度系統(tǒng)HPLC儀(美國SSI公司),包括SeriesⅢ型泵、Model500型UV-Vis檢測器和7725i進樣閥;TU-1800紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);HL-2型恒流蠕動泵(上海青浦滬西儀器廠)。山奈酚購自上海同田生化科技有限公司,批號:05010802,含量≥99%;苯酚紅、抗壞血酸均購自天津科密歐化學試劑開發(fā)中心;戊巴比妥鈉購自佛山市化工實驗廠;Krebs-Ringer's營養(yǎng)液(簡稱K-R液)按藥典2005版配制;tween-80購自成都長聯(lián)化工試劑有限公司;乙腈和醋酸均為色譜純,水為三蒸級純化水,其他試劑均為分析純。Wistar大鼠,雄性,體質量170~200g,購自四川大學實驗動物中心。1.2貯備液的設計供試液:取山奈酚10mg,精密稱定,置于100mL容量瓶中,用乙醇稀釋定容,得濃度約為100μg/mL的貯備液。分別精密吸取貯備液適量,用乙醇稀釋定容至10mL,得高、中、低3個濃度的乙醇藥液。精密吸取藥液1mL于100mL容量瓶,加入增溶劑,用含0.2%抗壞血酸的K-R液稀釋定容,即得。酚紅補液的配制:精密吸取乙醇1mL及與供試液相同比例的增溶劑,用含0.2%抗壞血酸和20μg/mL酚紅的K-R液稀釋定容至100mL。1.3實驗方法1.3.1回收率、精密度與定量限酚紅標準曲線的制備:精密稱取酚紅8mg,用K-R液溶解并定容至100mL。精密吸取適量,用K-R液連續(xù)稀釋,配制成濃度分別為4、8、16、32、64、80μg/mL的酚紅系列工作液。分別取上述溶液各0.5mL,置7mL塑料離心管中,準確加入0.2mol/LNaOH5mL,顯色10min,在558nm處測吸光度(A)值。以吸光度A對酚紅質量濃度ρ(μg/mL)進行線性回歸,得回歸方程A=0.0155ρ+0.0067(r=0.9999),高(64μg/mL)、中(16μg/mL)、低(4μg/mL)濃度的平均回收率分別為100.00%、100.00%、91.13%(n=5),日內精密度分別為0.43%、0.78%、4.75%(n=5)。酚紅含量的測定:將大鼠在體腸循環(huán)液不同時間點的樣品分別用0.45μm微孔濾膜過濾,取0.5mL續(xù)濾液,準確加入0.2mol/LNaOH溶液5mL,以0.2mol/LNaOH溶液為空白,在558nm處測定A值。將A值代入標準曲線方程求得酚紅質量濃度。1.3.2循環(huán)溶液中藥物質量濃度的測定1.3.2.流動相、柱溫度shim-packODSC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm);流動相為乙腈-水(40∶60,水相為0.6%的醋酸溶液),流速為1.00mL/min;柱溫為40℃;測定波長370nm。1.3.2.樣品的制備和測定分別取空白循環(huán)液(含0.2%抗壞血酸和20μg/mL酚紅的K-R液,大鼠小腸循環(huán)灌注2.5h即得)、K-R液+山奈酚標準品溶液、樣品溶液在上述色譜條件下進樣,由附圖可知,對照液與樣品溶液中山奈酚出峰時間一致,約為5.02min,空白循環(huán)液中酚紅和其它成分不干擾測定。1.3.2.回收率與精密度精密吸取濃度約為100μg/mL的乙醇貯備液1mL,置于100mL容量瓶,加入0.1g/mLtween-801mL,用含0.2%抗壞血酸的K-R液稀釋定容,得濃度為1000ng/mL的溶液,再用含0.001g/mLtween-80、0.2%抗壞血酸的K-R液連續(xù)稀釋,配成濃度約為20、40、100、200、400、800、1000ng/mL的標準曲線系列工作液,取20μL注入液相色譜儀,以峰面積A對藥物質量濃度ρ(ng/mL)進行線性回歸,得回歸方程A=58.015ρ-105.05(r=0.9999),表明在20.04~1000.18ng/mL范圍內,線性關系良好。高(800.14ng/mL)、中(200.04ng/mL)、低(40.08ng/mL)濃度的平均回收率為(98.96±1.69)%、(100.06±1.62)%、(100.02±3.02)%(n=5),日間精密度為1.71%、1.62%、2.95%(n=5),日內精密度為2.07%、1.71%、3.64%。按信噪比(S/N)=3計算山奈酚最低檢測限為10.02ng/mL,最低定量限為20.04ng/mL。1.3.2.實驗腸管處設置取實驗前禁食12h、體質量為200g左右的Wistar大鼠,隨機分組,每組5只,腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)。麻醉后固定,沿腹中線打開約3cm,在實驗腸管兩端各切一小口,在上端小口處插入玻璃管并結扎,用注射器將37℃的生理鹽水緩緩注入腸管,洗去腸管內容物至凈。然后在實驗腸管下端小口處插入玻璃管并結扎,將玻璃管與蠕動泵的膠管相連,形成回路,開動蠕動泵。先調節(jié)流速為5mL/min,平衡10min后調節(jié)流速為2.5mL/min。每隔15min取樣,每次取出1.0mL,并立即補充酚紅補液1.0mL。所取循環(huán)液經0.45μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液0.5mL進行酚紅含量的測定,20μL注入高效液相色譜儀進行山奈酚含量的測定。1.4酚吸收速率的測定對每個實驗因素幾個考察水平下得出的山奈酚吸收速率常數(shù)Ka和每小時吸收百分率P進行方差分析(兩兩比較采用q檢驗)和雙側t檢驗,檢驗水準α=0.05。2結果2.1山奈酚標準品溶液的制備以空白循環(huán)液為溶劑,配制高(800ng/mL)、中(150ng/mL)、低(75ng/mL)3個濃度的山奈酚供試液,置于37℃中水浴,分別于0、2、4、6h取樣,20μL注入高效液相色譜儀,記錄峰面積。以各時間點下峰面積與零時刻峰面積的比值來表示藥物剩余百分率,結果見表1,表明藥物在空白循環(huán)液中至少能穩(wěn)定6h。2.2大鼠對體腸的吸收2.2.1藥物吸收速率和吸收速率計算以中濃度(75ng/mL)供試液在小腸全腸段循環(huán),考察結扎膽管與否對山奈酚腸吸收的影響。以剩余藥量的對數(shù)對取樣時間作圖,求得藥物吸收速率常數(shù)Ka、吸收半衰期t1/2和每小時吸收百分率P,結果見表2。數(shù)據分析顯示,結扎膽管與不結扎膽管兩組的山奈酚腸吸收參數(shù)值的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明在本實驗條件下,結扎膽管對山奈酚腸道吸收影響不大。2.2.2山奈酚小鼠吸收參數(shù)的差異分別以高、中、低3個濃度的供試液在小腸全腸段循環(huán),考察濃度因素對山奈酚小腸吸收的影響,結果見表3。數(shù)據分析顯示,給予不同濃度的供試液,山奈酚小腸吸收參數(shù)Ka和P值不同(P<0.05),其中高濃度組與中濃度組無差別,高濃度組與低濃度組、中濃度組與低濃度組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),即低濃度組>中濃度組≈高濃度組。提示山奈酚在小腸的轉運可能存在載體介導。2.2.3山奈酚在各個腸段的吸收以400ng/mL的供試液考察十二指腸、空腸、回腸、結腸的吸收情況,結果見表4。數(shù)據分析顯示,山奈酚在各個腸段的吸收有差異(P<0.05),其中十二指腸的Ka和P值大于其余各腸段(P<0.05),而空腸、回腸、結腸間Ka和P值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示十二指腸可能為山奈酚的最佳吸收部位。2.2.4tween-80對山奈酚小鼠吸收的影響分別以3個濃度的tween-80為增溶劑,考察中濃度(150ng/mL)供試液的小腸吸收情況,結果見表5。數(shù)據分析顯示,不同濃度的tween-80對山奈酚的小腸吸收有影響(P<0.05),其中0.01g/mLtween-80組小于0.001g/mL組和0.002g/mL組(P<0.05),而0.001g/mL組與0.002g/mL組間Ka和P值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？烧J為1%的tween-80能抑制小腸對山奈酚的吸收。3tween-80對山奈酚的吸收作用本實驗采用大鼠在體腸吸收模型考察了山奈酚吸收特性,為藥物臨床應用和制劑的開發(fā)提供了一些信息。實驗結果表明,膽汁排泄和膽汁分泌在本實驗條件下不影響山奈酚的吸收;十二指腸為山奈酚最佳吸收部位,提示可應用制劑學方法控制山奈酚在十二指腸的滯留時間,以提高其吸收程度,從而提高其生物利用度;山奈酚吸收速率常數(shù)隨藥物濃度的增加而減小,提示其吸收并非簡單的被動擴散,可能有轉運載體的介導,提示臨床用藥時應注意藥物的給藥劑量;增溶劑tween-80濃度對藥物吸收有影響,0.01g/mL的tween-80能減少腸道對山奈酚的吸收,提示制劑中選用輔料時應考慮輔料的種類和用量。有文獻報道1g沙棘黃酮粗品濃縮液(含總黃酮24%左右)酶解后含山奈酚12.49mg,占總苷元的9.95%。而沙棘有效部位醋柳黃酮臨床常用劑量為每次10~20mg(按總黃酮計),按照人與大鼠劑量換算關系,本研究最后確立山奈酚腸灌注液的中濃度為150ng/mL。由于檢測方法定量限的限制,確立低濃度為75ng/mL。山奈酚不溶于水,結構中存在的多個酚羥基使其很容易被氧化,因此腸灌注液的配制是本課題首先要解決的問題,考慮到山奈酚溶于乙醇,且乙醇的毒性較小,本實驗采用乙醇配制山奈酚貯備液,用tween-80增溶,再用含0.2%抗氧化劑抗壞血酸的K-R液來稀釋定容。Brand等的研究表明口服乙醇后,乙醇通過脂質過氧化反應破壞脂質雙分子層是經皮吸收的藥物吸收增加的潛在機制之一。由于溶解性的限制,無法做陰性對照來確切的考察乙醇對吸收的影響程度。為了減少乙醇對吸收的影響