外植體褐化的發(fā)病機(jī)制及防治

外植體褐化的發(fā)病機(jī)制及防治

在植物組織培養(yǎng)中提到的黃褐色是指在外植體誘導(dǎo)初始分化或再分的過程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放棕色物質(zhì)，培養(yǎng)基逐漸轉(zhuǎn)化為棕色，外植體隨后褐死。褐化現(xiàn)象主要發(fā)生在外植體，在植物愈傷組織的繼代培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)以及原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)中也經(jīng)常發(fā)生。褐化產(chǎn)物不僅使外植體、細(xì)胞、培養(yǎng)基褐變，而且對許多酶有抑制作用，影響培養(yǎng)材料的生長與分化，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致材料死亡。褐化、污染和玻璃化并稱為植物組織培養(yǎng)的三大難題，且控制褐化比控制污染和玻璃化更加困難，因此，有人認(rèn)為，褐化能否得到有效控制是植物組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵所在。1褐變的酶底物褐化分為酶促褐化和非酶促褐化。非酶促褐化是由于細(xì)胞受脅迫條件或其他不利條件影響所造成的細(xì)胞死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡而導(dǎo)致的褐化，其中未涉及到酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。酶促褐化是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)的參與而引起的褐化現(xiàn)象。目前認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐化主要是酶促褐化。酶促褐化必須具備酶、底物和氧3個條件。引起褐化的酶有多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PLA）等，而目前普遍認(rèn)可的誘發(fā)褐化的酶類是多酚氧化酶。PPO是一種含銅酶，它的活性依賴于銅的氧化還原作用。該酶適宜反應(yīng)體系的pH范圍為5.8～6.8，其不耐熱，40℃以下活性穩(wěn)定，45℃以上活性迅速下降。PPO可以催化2種不同的反應(yīng)，即催化含1個羥基的酚形成二醌和催化鄰苯二酚形成二醌。引起褐變的酶底物主要是酚類化合物，它是植物界中種類最多、分布最廣的次生代謝物質(zhì)之一。酚類物質(zhì)的共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是含有帶羥基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，按其組成結(jié)構(gòu)可分為苯基羧酸類（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等）、苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等）、黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等）三大類。酚類物質(zhì)是一類有害的次生代謝產(chǎn)物，在植物細(xì)胞中能與蛋白質(zhì)或酶發(fā)生氫鍵締合，能與許多金屬離子絡(luò)合，其氧化產(chǎn)物醌在植物細(xì)胞內(nèi)既能自我聚合，也能與含有羥基、氨基和巰基之類的化合物發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生有色物質(zhì)，導(dǎo)致組織的褐變。酶和底物的深入研究已經(jīng)為酶促反應(yīng)體系理論的研究奠定了基礎(chǔ)。Mayer在進(jìn)行組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)的含量與其褐變率成正相關(guān)，提出了果實(shí)組織細(xì)胞中酚類物質(zhì)和PPO的區(qū)域化分布假說，認(rèn)為在正常發(fā)育的植物組織中，底物、氧氣、PPO同時存在并不發(fā)生褐變，這是因?yàn)樵谡５慕M織細(xì)胞內(nèi)由于多酚類物質(zhì)分布在細(xì)胞的液泡內(nèi)，而PPO則分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，這種區(qū)域性分布使底物與PPO不能接觸。當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時，就為酶與PPO的接觸創(chuàng)造了條件，在氧存在的情況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進(jìn)行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，最后形成黑褐色物質(zhì)，從而引起褐化。鞠志國證實(shí)，萊陽梨細(xì)胞中的酚類物質(zhì)集中于液泡，而PPO則主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，并且果實(shí)內(nèi)總酚含量與其褐變密切相關(guān)。陳秀芳等在研究果實(shí)成熟過程中某些酚含量和PPO活性變化的關(guān)系時，證明了褐變程度與總酚含量以及PPO活性之間存在一定的關(guān)系，但因品種而異。而羅曉芳等的研究表明，多酚氧化酶的活性與組織培養(yǎng)材料的褐變不呈正相關(guān)，但酚類物質(zhì)的總含量與褐變有一定的關(guān)系，同時易褐變材料的褐變程度隨培養(yǎng)時間的延長不斷增加。2外植體生理特性及成因引起組織培養(yǎng)過程中外植體褐變的因素包括2個方面：一是外植體自身的原因，包括外植體的生理狀態(tài)、生長狀態(tài)、遺傳特性等；二是外植體所處的培養(yǎng)環(huán)境，包括培養(yǎng)基的成分及培養(yǎng)條件。2.1花藥培養(yǎng)中愈傷組織的誘導(dǎo)在植物組織培養(yǎng)中，不同物種之間褐化程度差異很大，就是同種植物的不同品種間也存在一定差異。如橡膠樹的花藥培養(yǎng)中，海墾2號花藥的褐變較少，因而愈傷組織誘導(dǎo)容易，而有些品系花藥容易褐化，誘導(dǎo)困難；銀杏的眾多品系中，佛手品系比梅核品系愈傷組織誘導(dǎo)困難。這些可能是由于外植體的基因型差異引起的。2.2褐化、褐化材料的研究邱璐等研究發(fā)現(xiàn)，用桑樹基部發(fā)出的幼芽作外植體比用上部壯枝上的壯芽作外植體褐化輕、褐化率低；幼齡樹比老齡樹褐化輕、褐化率低。Gannoun等報道，阿月渾子2年和4年生材料的組織培養(yǎng)獲得成功，但8年和26年生材料則出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。陳正華進(jìn)行枇杷的微莖尖（1mm以下）培養(yǎng)時因酚類物質(zhì)褐化死亡；在進(jìn)行較大的莖尖培養(yǎng)時褐化現(xiàn)象會消失。Wang等報道，富士蘋果和金華桃在9月到2月取材褐變輕，5月到8月取材褐變重?？梢?，外植體的選擇對組織培養(yǎng)的成敗至關(guān)重要。2.3組織培養(yǎng)中外植體的褐化過高的無機(jī)鹽濃度會引起植物外植體的褐化，這在油棕和云桑的組織培養(yǎng)中得到了體現(xiàn)。蕓苔屬植物光照時間過長、光照強(qiáng)度過大都會使褐化現(xiàn)象變得嚴(yán)重，甘蔗胚性細(xì)胞在過強(qiáng)的光照（2500lx以上）下，細(xì)胞團(tuán)表面容易褐變，弱光下則會出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。高溫能促進(jìn)酚類氧化，而低溫可以抑制酚類化合物的合成，可以降低多酚氧化酶的活性，減少酚類氧化，從而減輕褐變。抗氧化劑對核桃、桑樹和荔枝的組織培養(yǎng)中外植體的褐化程度影響很大。在水稻的體細(xì)胞培養(yǎng)中，pH為4.5～5.0的MS培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態(tài)，而pH為5.5～6.0時，愈傷組織嚴(yán)重褐化。以上研究表明，除植物體的自身原因外，培養(yǎng)環(huán)境對褐化的影響也不容忽視。3防止棕櫚樹組織培養(yǎng)過程中，材料的褐化往往是多種因素共同作用的結(jié)果，抑制或降低組織培養(yǎng)中褐化的主要途徑如下。3.1外植體的加工外植體組織的受傷害程度直接影響褐變的發(fā)生。Bonga等認(rèn)為，外植體越小，切面與體積的比率越大，傷害及褐化的程度越大，這在巨桉和卡德蘭的組織培養(yǎng)中得到了驗(yàn)證。Pruveni和Kipnis用椰子的完整胚、葉片作外植體進(jìn)行培養(yǎng)也很少發(fā)生褐變。因此，在切取外植體時，應(yīng)盡可能減少其傷口面積，傷口剪切盡可能平整。切取外植體時還應(yīng)考慮其粗度，細(xì)的可切短些，粗的可切長些。3.2外植體的消毒處理預(yù)處理包括：流水沖洗、低溫消毒、預(yù)培養(yǎng)等。對易褐變的材料經(jīng)流水沖洗后放在2～5℃的低溫下處理12～24h，經(jīng)消毒處理后接種到只含有蔗糖和瓊脂的培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7d，一方面使培養(yǎng)基中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)基，另一方面使外植體傷口愈合，這樣可使外植體褐化程度減輕。李麗梅等認(rèn)為，預(yù)冷可減輕黃冠梨果皮褐變的發(fā)生率。3.3外植體防褐化能力組培中外植體的褐化是植物在一種逆境下的適應(yīng)性反應(yīng)，故此，在最適宜的培養(yǎng)條件下，外植體處于旺盛的生長狀態(tài)，有較強(qiáng)的分生能力，便可大大減輕褐化。蘋果M7使用1/2MS培養(yǎng)基可減輕褐化?？ǖ绿m開始培養(yǎng)時，溫度保持在15～20℃，培養(yǎng)基pH調(diào)至5.5，有助于減輕褐化的程度。3.4防控部曲子型向酚類物質(zhì)褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO的抑制劑。黃浩等認(rèn)為，水解乳蛋白的抗褐變原因，一方面是弱酸性物質(zhì)與酚類的羥基作用形成酯類，減少了PPO作用底物的濃度；另一方面是水解乳蛋白競爭性地與底物結(jié)合的結(jié)果。亞硫酸鹽可直接抑制酶，它與反應(yīng)的中間體相互作用，阻止中間體參與反應(yīng)形成褐色素，或作為還原劑促進(jìn)了醌向酚的轉(zhuǎn)變。此外，硫脲、二氨基二硫代甲酸鈉、氯化鈉也是PPO的抑制劑。可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，用于防止褐化的發(fā)生?；钚蕴渴且环N吸附性較強(qiáng)的無機(jī)吸附劑，能吸附各種微量物質(zhì)和微小顆粒，亦可用來防止組培中褐變的發(fā)生和發(fā)展。何瓊英等在苦丁茶體細(xì)胞組織培養(yǎng)前，將苦丁茶莖段經(jīng)常規(guī)消毒后，用可溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP,2g/L）浸泡10～15min，并在培養(yǎng)基中加入活性炭（AC,1g/L），獲得了較好的防褐效果。3.5外植體接種后轉(zhuǎn)移將外植體很快轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上2～3次，在某些情況下可以緩解褐化，可能是在這段時間內(nèi)外植體的切口逐漸愈合、外滲停止的原因。在蘭花、無花果、核桃的組培中使用了這個方法，收到了良好效果。在外植體接種后的1～2d立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中或同一瓶培養(yǎng)基的不同部位，這樣能減輕醌類物質(zhì)對培養(yǎng)物的毒害作用，連續(xù)轉(zhuǎn)移5～6次可基本解決外植體的褐變問題。此法比較經(jīng)濟(jì)簡單，應(yīng)是克服褐變的首選方法。但是工作量較大。4褐化的生理作用在植物組織培養(yǎng)中，引起褐化的因素是復(fù)雜的，既有培養(yǎng)物自身的原因，也有培養(yǎng)環(huán)境的影響，而且往往是多種因素同時作用的結(jié)果。因此，深入了解有關(guān)機(jī)制是從理論上認(rèn)識組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象、找到影響褐變的主導(dǎo)因子和克服褐變的有效方法，并可從實(shí)踐上防止褐化的發(fā)生，這對解決組織培養(yǎng)生產(chǎn)中的褐化這一難題、促進(jìn)組織培養(yǎng)技術(shù)的日臻完善具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。酶促褐變存在著不同物種間的基因型差異，因此對褐化較