新月組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

新月組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

玫瑰是薔薇科的多年生葉子和多年生灌木。它是中國最早的傳統(tǒng)花之一，也是世界上最古老的花之一。它起源于中國，17年前在歐洲傳入世界。目前月季的繁殖技術(shù)仍沿襲了傳統(tǒng)的扦插、嫁接、壓條等方法，這些方法限制了月季的繁殖量，不能滿足工廠化大生產(chǎn)發(fā)展的需要。1980年Hasegawa成功在MS培養(yǎng)基上建立了月季試管苗無性系，開辟了月季組培的先河。利用組培的方法繁殖月季速度快、質(zhì)量高，同時也利于月季的育種研究。隨著月季組培技術(shù)的發(fā)展，不斷有研究者探討影響月季離體快速繁殖的因素，發(fā)現(xiàn)這些影響因素不是單一的，其中主要影響因素有外植體的選擇與滅菌、組培各階段中的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件選擇等，本文對這些影響因素的研究作一綜述，為月季的工廠化生產(chǎn)提供依據(jù)。1不同接種方式對再生芽的影響月季組培外植體通常采用帶芽莖段。同一枝條上不同部位的腋芽誘導(dǎo)效果不同。取枝條中部的腋芽效果最好，這可能與月季枝條不同部位的腋芽成熟程度及休眠狀態(tài)不同等因素有關(guān)。很多研究都證明枝條中部的腋芽萌發(fā)較頂部和基部時間早，且中部的腋芽長勢好，增殖系數(shù)高，其次是基部，再次是頂部。但Podwyszynska等的研究表明，外植體以第2節(jié)位的腋芽最有利于增殖。幾乎所有研究月季組培的工作者都會利用帶芽莖段進(jìn)行培養(yǎng)，但也有少數(shù)采用葉片、葉柄、葉盤為外植體。采用頂芽（即莖尖）的效果不如帶芽莖段。沈國正等分別以莖段和頂芽為外植體，發(fā)現(xiàn)以莖段為繼代材料的增殖系數(shù)均優(yōu)于以頂芽為繼代材料的增殖系數(shù)?？梢?，帶芽莖段是月季組培的最佳外植體。外植體的休眠狀態(tài)對芽的萌動和滅菌也有影響。李青等采用1年生枝條的冬芽和當(dāng)年生枝條的腋芽為外植體進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)越冬芽較嫩枝條的芽成活率高，且萌動所需時間較短，主要原因是芽內(nèi)積累了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，在適宜的條件下很快萌發(fā)生長；而春季嫩枝上的芽，由于剛剛形成且未經(jīng)休眠，所以本身較弱，但越冬芽污染率高于嫩枝芽。外植體的接種方式影響再生芽生長量。朱建鏞等在研究兩種微型月季品種的單節(jié)組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，將莖段平放、直插或斜插，所長出新枝條的鮮重和干重比將莖段倒插所長出的新枝條重。于冰沁對微型月季的研究表明，垂直接種、斜向上45°接種是最佳的接種方式，水平接種其次，反轉(zhuǎn)接種的腋芽再生芽生長量明顯低于前3種接種方式，這可能與枝條原有的生長極性有關(guān)。外植體滅菌方法很多，使用藥劑不一，但其目的是要得到無菌、正常的活體材料，因此應(yīng)根據(jù)材料的不同來決定滅菌程序和處理時間。月季外植體滅菌通常采用70%或75%的酒精滅菌一定時間（60s以內(nèi)）后，再在0.1%HgCl2中滅菌8～15min，也有采用次氯酸鈉溶液和新潔爾滅菌的。滅菌時間的長短是影響滅菌效果的關(guān)鍵。韓秀慧等研究表明時間對污染率影響最大，消毒液濃度及消毒方式次之。值得注意的是，雖然消毒液濃度過大或處理時間過長的滅菌效果好，但往往容易引起植物中毒，使表面組織破壞、顏色變黑，失去萌芽力。張宇斌等的研究就說明隨著HgCl2處理時間的延長，月季的污染率逐漸降低，而成活率也有下降趨勢。選擇外植體的時間對滅菌的效果也有影響，大體表現(xiàn)為春秋兩季較好。春季植物體內(nèi)的內(nèi)源激素含量相對高，枝條孕育著極強的生命力，而且?guī)Ь肯鄬^少；秋季的溫、濕度和光照都非常適合月季生長，使其枝條、葉片、花色、花型等均能得到充分體現(xiàn)，因植株健壯，其枝條更具有抗藥性，且此時高溫、高濕季節(jié)已過，接種后不易污染，啟動較快。除特殊需要外，應(yīng)盡量避免夏季和冬季啟動組培繁殖。特別是雨季，氣溫高、濕度大，帶菌量也大，會增加消毒的難度。張宇斌等的研究表明，在春季HgCl2處理的最適條件是6min，而在秋季為15min，春季月季比秋季月季具有更高的成活率和更低的污染率。原因是春季大量細(xì)菌、真菌等雜菌正處于生活期，易被HgCl2殺死；秋季各種雜菌多處于休眠期，HgCl2很難將其殺死，待外植體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基后，在合適的溫度和濕度下，雜菌恢復(fù)活力，進(jìn)而造成污染。滅菌前采用適當(dāng)?shù)拇胧┛梢越档臀廴韭?、提高外植體的萌發(fā)，如消毒前對莖節(jié)用毛刷刷洗和用合適濃度的青霉素以及多菌靈混合液處理或者采用磁力攪拌均可提高滅菌效果，而Halmagyi等對誘導(dǎo)24h后的離體芽尖實行冷藏處理也能提高芽的再生率。2植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇月季組培的培養(yǎng)基大體分為啟動培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基（增殖培養(yǎng)基）、生根培養(yǎng)基，有的還有壯苗培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分均包括糖（碳源）、無機鹽（營養(yǎng)源）、激素配比（生長素與細(xì)胞分裂素的比例）。影響月季組培的植物生長調(diào)節(jié)劑主要有細(xì)胞分裂素（6-BA、ZT、ZR、2iP、ipA和TDZ等）、生長素（NAA、IAA、IBA等）和赤霉素（GA3)3種。細(xì)胞分裂素參與克服頂端優(yōu)勢的過程，因而能促進(jìn)側(cè)枝的萌發(fā)和生長，嫩芽的繁殖主要是細(xì)胞分裂素影響的結(jié)果。生長素最明顯的作用是促進(jìn)生長，但其促進(jìn)作用因濃度而異，較低濃度促進(jìn)生長，較高濃度抑制生長。2.1完善誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分直接影響外植體的萌動和分化。培養(yǎng)基的濃度不適合會導(dǎo)致新生芽矮小或形成愈傷組織，還可能出現(xiàn)玻璃狀苗、導(dǎo)致新芽徒長。實際上，在組培過程中，即使使用不含激素的培養(yǎng)基，只要外植體沒有污染，枝條的養(yǎng)分充足，就能使新芽長出。Davies報道了不同品種月季在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上都可進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)。而Rout等報道稱，在不添加激素的培養(yǎng)基中芽的誘導(dǎo)率高，但速度慢（10～12d），而在培養(yǎng)基中加入6-BA或6-BA+GA3則6～8d即可誘導(dǎo)出芽，并可提高芽的增殖率，但在培養(yǎng)基中只添加6-BA(2～3mg/L）則苗生長緩慢，誘導(dǎo)率為63%～80%，若在加入6-BA的同時添加GA3(0.1～0.25mg/L）則可將芽的誘導(dǎo)率提高至95%，增殖倍數(shù)提高至7倍。啟動培養(yǎng)基一般以MS為基本培養(yǎng)基，激素以細(xì)胞分裂素和生長素結(jié)合使用，較常使用的有6-BA、NAA、GA3。其中，6-BA的有效濃度為0.5～3.0mg/L，有的甚至達(dá)到4mg/L、5mg/L；NAA的有效濃度為0.01～0.5mg/L。吳淑平等進(jìn)行豐花月季的組培時發(fā)現(xiàn)，加入0.05mg/LGA3誘導(dǎo)效果更好。林小潔等報道稱，月季芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+GA30.2mg/L。芽的萌動還受溫度的影響，莫磊興等利用莖段腋芽誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)高溫對腋芽的萌發(fā)有明顯的抑制作用，莖段腋芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.15mg/L，溫度26℃左右。外植體可先誘導(dǎo)愈傷再進(jìn)行分化，愈傷誘導(dǎo)大部分以MS為基本培養(yǎng)基，也有采用其他培養(yǎng)基的。趙松峰在測試MS、WPM（木本植物培養(yǎng)基）、B5和White等4種培養(yǎng)基對月季葉片的愈傷組織誘導(dǎo)的影響時發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基對葉片誘導(dǎo)程度表現(xiàn)為MS>B5>WPM>White。誘導(dǎo)愈傷組織使用的激素除了6-BA、NAA，還有2,4-D、KT或ZT。趙培培等采用葉片、葉柄和莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)均獲得了愈傷組織，愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+2,4-D5.0mg/L+6-BA1.0mg/L。劉會超等以試管苗的幼嫩小葉為外植體，使用5.0mg/L2,4-D能有效誘導(dǎo)愈傷組織。林婭等研究表明，KT或ZT與NAA組合能較好地誘導(dǎo)月季愈傷組織，激素濃度主要影響愈傷組織的顏色和質(zhì)地；一般生長素濃度越高，愈傷組織顏色偏向于黃色，質(zhì)地也越松散；但是當(dāng)生長素達(dá)到一定濃度時，有些品種會發(fā)生不定根，并且不同品種適宜的激素濃度不同。實際上，無論是愈傷組織的誘導(dǎo)還是分化都表現(xiàn)出明顯的品種特異性。有的品種誘導(dǎo)率低；有的品種盡管誘導(dǎo)率達(dá)100%，但誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)量少或者愈傷組織質(zhì)地不理想；有的品種愈傷組織生長勢弱，在繼代過程中逐漸死亡。因此只有在選擇適宜品種的基礎(chǔ)上，改良培養(yǎng)條件，才能逐漸優(yōu)化月季的再生體系。2.2不同濃度及光照對缺失苗、分繼代培養(yǎng)受糖濃度、pH值、激素配比的影響。糖量加大、pH值降低會使月季繼代苗分化率提高20%，同時可縮短繼代周期，但糖濃度不可超過50g/L,pH值不可低于5.5。適宜的激素種類和濃度配比是月季腋芽萌發(fā)和叢生芽增殖的關(guān)鍵。繼代培養(yǎng)中常使用的激素有6-BA、NAA、IBA、GA3，少數(shù)采用TDZ、KT、ZT、IAA、ETH。6-BA的有效濃度為0.1～3.0mg/L,NAA的有效濃度為0.005～0.5mg/L、也有用到1.0～2.0mg/L，IBA的有效濃度為0.01～0.3mg/L。低濃度的6-BA有利于不定芽的增殖，濃度過高則抑制不定芽增殖；合適濃度的NAA有利于芽和葉生長，但濃度過高誘導(dǎo)產(chǎn)生大量愈傷組織，不利于側(cè)芽的直接分化和生長。乙烯也能提高月季芽的增殖率，其效果與濃度有關(guān)，以5mg/L最佳，但乙烯不利于苗的長高。除受激素的影響外，繼代培養(yǎng)還受環(huán)境因子的影響。莫磊興等研究了光照強度對嫩莖增殖的影響，發(fā)現(xiàn)在月季繼代培養(yǎng)過程中，光照強度與嫩芽的玻璃化程度有密切關(guān)系，光照強度越低，玻璃化程度越重，在光照強度相近的自然散射光和日光燈照射下，自然散射光的玻璃化率也明顯低于日光燈。月季繼代培養(yǎng)較適宜的光照是自然散射光3000lx左右。此外，培養(yǎng)瓶里的含水量、相對含水量、水汽壓都會影響月季芽的增殖。繼代時間的長短也會對增殖有影響，Chu等報道將繼代時間從3周延長至6周，微型月季的增殖率顯著提高。還有研究采用摘心等其他方法來提高增殖的。高彩云等在繼代培養(yǎng)的接種操作時，切去嫩芽的頂芽后，再轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上，對嫩芽增殖有很大的促進(jìn)作用。2.3生長量和光照對根系生長的影響多數(shù)試驗采用的生根培養(yǎng)基為1/2MS。Skirvin等在用Foreveryours月季做生根試驗時發(fā)現(xiàn)，采用1/4MS培養(yǎng)基，不添加生長素即可促進(jìn)生根。Davies在無激素的培養(yǎng)基中添加4%蔗糖，使幾個品種的月季全部生根。Hyndman等研究發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基中鹽濃度過高，特別是氮素含量過高會導(dǎo)致生根不適應(yīng)，因此需減少無機鹽用量。生根使用的激素主要為IBA、NAA、IAA等生長素，其中IBA有效濃度為0.01～1.0mg/L、NAA有效濃度為0.01～1.0mg/L、IAA使用較少；也有研究采用ABT的。任維英等采用的豐花月季試管苗生根技術(shù)ABT速蘸法，生根快、整齊，同時在不含激素的培養(yǎng)基中有利新生根的生長發(fā)育，生根階段試管苗苗高及木質(zhì)化程度明顯提高，該方法優(yōu)于普遍采用的將生長素加入培養(yǎng)莖中進(jìn)行誘導(dǎo)的生根技術(shù)。李正平在月季組織培養(yǎng)中使用ABT生根粉，促進(jìn)生根濃度為0.5～10.0mg/L，最佳濃度為0.5～2.0mg/L。此外，在培養(yǎng)基中加入活性炭可以顯著促進(jìn)生根量和根的長勢，添加濃度為0.2～0.3%，這可能與活性炭對有害酚類物質(zhì)的吸附有關(guān)，同時活性炭所造成的暗環(huán)境也可能有利于根的發(fā)生和發(fā)育。組培苗在生根階段對溫度的變化非常敏感。冷肖荀利用月季莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，生根的最適溫度為22℃左右。周慶華等研究了不同溫度下月季的生長情況，發(fā)現(xiàn)21℃時嫩莖生根數(shù)量最多，而在溫度低于或高于21℃時，嫩莖生根數(shù)量減少。姚曉惠等將月季的無菌嫩莖在5種不同溫度下進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生根階段對溫度的變化非常敏感，最適宜溫度為21℃。生根苗對光照的要求與繼代苗略有不同。置于燈光培養(yǎng)室的繼代苗，其葉色、根系及苗的粗壯度均不及日光培養(yǎng)室的苗，前者成活率70%～85%，后者可達(dá)85%～90%，可見，日光培養(yǎng)對苗有明顯優(yōu)勢。月季在生根過程中有瓶內(nèi)開花的報道，如洪燕萍在生根過程中在瓶內(nèi)獲得了正常結(jié)構(gòu)的月季小花，張作梅報道了微型月季試管開花最適宜培養(yǎng)基配方是1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+糖55g/L+瓊脂6g/L,pH5.8。組培苗的生根還與品種本身的特性有關(guān)，郗篤雋等以微型月季兩個品種的組培苗為材料，設(shè)計1個對照及14個不同激素濃度的生根培養(yǎng)基配方，探討其對組培苗形態(tài)指標(biāo)、成活率、生根率等的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微型月季品種間差異顯著。3移栽生根、栽植及基質(zhì)選擇組培苗的移栽是從一個無菌的環(huán)境到一個有菌的環(huán)境，在移栽中雜菌的侵染對小苗的生長影響很大，組培苗要經(jīng)過一個適應(yīng)階段，因此在移栽初期，要盡量防止雜菌污染。移栽前還要對小苗進(jìn)行煉苗，讓其先適應(yīng)溫室外的環(huán)境再進(jìn)行移栽。不同季節(jié)對移栽成活率有很大影響，夏天高溫高濕易爛苗、不宜移栽；春天移苗最好，原因是溫度適宜、濕度有保障、成活率高；秋天移苗后要注意保護(hù)小苗過冬；冬天移苗需在溫室內(nèi)進(jìn)行。就苗而言，最好的移栽生根苗應(yīng)是根未老化、莖葉最強壯的苗，這種苗移栽成活率最高。如果生根苗的根已發(fā)黑，說明根已老化，移栽成活率較低。如果在生根培養(yǎng)基中添加0.3%左右的活性炭，可使苗生根時間較一致，并推遲根老化的時間。移栽后配施0.1%的多菌靈、百菌清等，可以預(yù)防微生物對幼苗根的的侵染，提高成活率。移栽的土壤宜用素沙土，蛭石、珍珠巖、泥碳和細(xì)沙及其組合也是常用的移栽組培苗的基質(zhì)。如果土壤是重復(fù)利用，必須進(jìn)行消毒，暴曬或噴藥均可。一般情況下，移栽在苗床上的苗較移栽在常養(yǎng)缽中的成活率高，這是因為前者較后者的溫度和濕度穩(wěn)定。王子迎等對切花月季組培苗移栽進(jìn)行研究，12種移栽基質(zhì)中以蛭石的栽培效果最好，所有含泥碳的基質(zhì)的栽培效果都不好，用殺菌劑持續(xù)處理移栽基質(zhì)控制雜菌污染比基質(zhì)一次性滅菌的效果好，先用自來水培養(yǎng)10d后再用