1四氯化碳ccl4肝毒性的研究進(jìn)展

1四氯化碳ccl4肝毒性的研究進(jìn)展

肝臟疾病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪菍?shí)驗(yàn)和臨床假設(shè)的基礎(chǔ)。該模型的建立有助于研究肝臟疾病的病因、病理生理和治療。藥物中毒性肝損傷模型的建立1.四氯化碳(CCl4)CCl4是最早、最廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型的選擇性肝毒性物質(zhì),機(jī)制為:CCl4的活性代謝產(chǎn)物三氯甲基根(-CCL3)刺激產(chǎn)生活性中間產(chǎn)物(ROI),造成脂質(zhì)過氧化,引起細(xì)胞損害,結(jié)締組織產(chǎn)生過多。誘導(dǎo)微粒體細(xì)胞色素P450同工酶活性的物質(zhì)可增加CCl4產(chǎn)物的肝毒性,因此在制模過程中加入戊巴比妥或乙醇代替飲水是加速肝損傷進(jìn)程的常用方法。急性肝功能衰竭模型:SD大鼠(體重250~320g)4ml/kg,CCl4灌胃;肝纖維化模型有單純法和復(fù)合法。單純法:采用Wistar大鼠(體重85~95g),腹腔注射CCl40.025ml(以花生油1∶6稀釋),每周3次,共4周;采用Wistar大鼠,40%CCl4石蠟油溶液第1天皮下注射0.5ml/100kg體重,以后每隔4d皮下注射0.3ml/100kg體重,共10次;SD大鼠(體重230~260g),輪替四肢皮下注射50%植物油CCl4溶液0.3ml/100kg體重,每周2次,共8周。復(fù)合法:Mclean在飲水中加入苯巴比妥(350ml/l),CCl4蒸氣吸入;Proctor讓大鼠飲用含苯巴比妥(350ml/l)的水2周肝極度腫大后,以CCl4灌胃0.2ml/kg體重,5d1次,8~10周成模;韓德五以高脂蛋白食物(玉米面)為大鼠飼料,加0.5%膽固醇,實(shí)驗(yàn)第1、2周加20%豬油),以30%酒精為唯一飲料,皮下注射CCl4(第一次用0.5ml/100kg體重,以后每隔3d皮下注射40%油劑CCl40.3ml/100kg體重,共6周);孫敬方向Wistar或SD大鼠皮下注射45%~50%油溶液,0.3ml/100kg體重,每周2次,第2周開始,隔日以20%~30%乙醇1ml灌胃,飼以混有0.5%膽固醇低膽堿飼料,共8周。以上所述為幾種經(jīng)典、具有代表性的方法,其它很多方法都是在此基礎(chǔ)上的改良,如腹腔內(nèi)注射CCl4加飲用苯巴比妥鈉和食用酒精等。目前多選用鼠造模,因鼠繁殖力強(qiáng),生命力旺盛,價(jià)格低廉,也有選用兔,因兔血容量大,肝臟大小適中,其肝損傷易于生化及影像學(xué)觀察,選用大動(dòng)物模型如犬亦有成功報(bào)道。給藥途徑有多種,如皮下注射、腹腔注射、灌胃、蒸氣吸入或拌于食物中快速口服等,優(yōu)劣各家說法不一。灌胃法CCl4經(jīng)過門靜脈系統(tǒng)吸收,直接進(jìn)入肝臟,模型制備理想,但操作復(fù)雜,腸道反應(yīng)大;腹腔內(nèi)注射門靜脈濃度高,肝損傷形成時(shí)間短,但病死率較高(20%~35%);皮下注射較腹腔注射具有如下缺點(diǎn),造模周期長,動(dòng)物病死率高,相應(yīng)增加了實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi),因操作不當(dāng)可以發(fā)生皮下滲漏,但操作簡(jiǎn)便;蒸氣吸入需快速吸入,呼吸道刺激大,動(dòng)物不耐受,中樞毒性大,易污染環(huán)境和傷害實(shí)驗(yàn)人員;溶于少許食物快速口服,少吃多餐,揮發(fā)減少,濃度低胃腸刺激減小,但受動(dòng)物食欲影響,劑量難以掌握,實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)不明確,周期長。2.D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)半乳糖胺是一種肝細(xì)胞毒性藥物,可在短時(shí)間內(nèi)引起嚴(yán)重肝損害,其作用機(jī)制是:①通過抑制肝細(xì)胞的RNA和漿膜蛋白合成造成肝細(xì)胞壞死;②肝細(xì)胞壞死與細(xì)胞外Ca2+大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有關(guān);③一些研究指出,腸外因素,包括胃腸通透性增加,細(xì)菌的移位和內(nèi)毒素等都增加了半乳糖胺的肝臟毒性。急性肝功能衰竭模型:大白豬頸外靜脈置管注射半乳糖胺(0.75g/kg體重),給藥18h,肝功能損害開始明顯,至48h達(dá)高峰,治療肝功能衰竭的各種措施可在這段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn),該模型適合進(jìn)行人工肝臟支持治療的研究;家豬經(jīng)門靜脈注射半乳糖胺0.5g/kg和脂多糖1μg/kg,與單用半乳糖胺(1g/kg)外周靜脈注射誘導(dǎo)大動(dòng)物急性肝功能衰竭模型相比,半乳糖胺用量減少了一半,聯(lián)合應(yīng)用脂多糖,兩藥有明顯協(xié)同作用。長期小劑量可導(dǎo)致肝纖維化和肝癌。半乳糖胺誘發(fā)的急性肝功能衰竭模型癥狀、生化、組織學(xué)表現(xiàn)接近人,重復(fù)性好,而且不造成環(huán)境污染及人體傷害等,對(duì)肝衰竭、肝性腦病、人工肝支持系統(tǒng)的評(píng)價(jià)研究有重要價(jià)值,缺點(diǎn)為半乳糖胺較昂貴。3.甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)DMN是常見的致肝癌劑,它通過微粒體代謝,其中間產(chǎn)物與細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)等結(jié)合致肝損傷,同時(shí)產(chǎn)生一種活性甲基化產(chǎn)物使核酸、蛋白質(zhì)甲基化導(dǎo)致肝壞死。急性肝損傷:單劑后12~18h出現(xiàn)肝細(xì)胞出血壞死周圍細(xì)胞脂變,24h廣泛壞死,嗜酸性變性,脂肪沉著,凋亡小體出現(xiàn),6d后壞死消失,殘留組織纖維增生,靜脈扭曲。肝纖維化模型:SD大鼠按10mg/kg體重,給予1%DMN生理鹽水稀釋液,腹腔注射10次。DMN誘發(fā)肝纖維化周期短,動(dòng)物病死率低,肝纖維化形成相對(duì)穩(wěn)定,主要用于肝硬化形成和門脈高壓機(jī)制的研究,還用于肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究。缺點(diǎn)為DMN毒性大,易揮發(fā),排泄物在24h內(nèi)含毒物,易污染環(huán)境和影響周圍人群。4.對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen,PAPA)PAPA是一種肝毒物,是經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后形成親電子代謝物致肝損傷的樣板,PAPA常用于制作急性肝功能衰竭模型,P450誘導(dǎo)劑加重肝損傷,先予以P450誘導(dǎo)劑和GSH合成酶抑制劑,再予PAPA復(fù)制的兔急性肝功能衰竭模型與人急性肝功能衰竭臨床特點(diǎn),組織學(xué)表現(xiàn)相似,是較理想的急性肝功能衰竭模型。5.其它硫代乙酰胺在實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物中致肝癌,肝細(xì)胞損傷反應(yīng)好,肝纖維化組織接近人類肝硬化表現(xiàn),誘發(fā)急性肝功能衰竭可表現(xiàn)肝性腦病,常用于制作肝纖維化和急性肝功能衰竭模型。另外,乙硫氨酸(ethionine),二甲基偶氮苯及黃曲霉素也可使肝細(xì)胞發(fā)生中毒性肝損傷。酒精性肝損傷動(dòng)物模型的建立酒精對(duì)肝損害的機(jī)制尚未完全闡明,可能是炎癥和免疫病理共同作用的結(jié)果,蛋白質(zhì)和各種營養(yǎng)物質(zhì)缺乏會(huì)加重酒精的肝損害。高濃度的酒精引起急性肝損傷,產(chǎn)生大量毒性代謝產(chǎn)物和乙醛,并釋放腎上腺素,引起肝臟血管收縮,肝竇內(nèi)壓升高和肝細(xì)胞缺氧,導(dǎo)致空泡變性,肝細(xì)胞溶解壞死。對(duì)酒精引起的慢性肝損傷研究較多。Liber-DeCarli液體食物模型:按熱量配置,蛋白質(zhì)占18%,脂肪21%,糖61%(糖熱量的50%由乙醇提供),管飼狒狒實(shí)驗(yàn)1~3年,1/3狒狒發(fā)生肝硬化,液體食物可完全控制食物與酒精的攝入量,該模型與人類酒精性肝硬化極為相似,但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昂貴,實(shí)驗(yàn)周期長,推廣困難。TsuKamoto-French模型:該模型采用大鼠,飼液體食物,采用植入人工胃管,酒精占攝入總熱量的47%,該模型可完全控制乙醇和營養(yǎng)物的攝入量,符合進(jìn)行性酒精性肝損傷,從肝脂變、小葉中心壞死、炎癥到肝細(xì)胞周圍、靜脈周圍肝纖維化。河金福等在大鼠常規(guī)喂養(yǎng)同時(shí)灌入酒精(56%)、橄欖油等的混合液,4周后電鏡下可見肝細(xì)胞周圍膠原纖維增生。陸倫根等用60%酒精按1.5ml/100g體重的劑量,灌胃,每日2次,低脂飲食,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水,6個(gè)月后肝細(xì)胞周圍脂肪變加重,可見中央靜脈周圍和竇周纖維化,高脂飲食可加重上述表現(xiàn)。丁霞等對(duì)Wistar大鼠每日清早灌胃白酒-玉米油-吡唑混合液,間斷給予高脂飼料,其中酒精攝入量為每天8~12g/kg隨時(shí)間的延長而遞增;玉米油的攝入量為每天2g/kg,吡唑的攝入量為24mg/kg造模時(shí)間為12周,經(jīng)Masson三色染色證實(shí)肝組織中膠原纖維明顯增生。乙醇與CCl4聯(lián)合應(yīng)用造模已有較多成功報(bào)道。吳孟超報(bào)道在小鼠使用該方法60d即可致肝硬化,肝硬化穩(wěn)定,分期明顯,動(dòng)物病死率低。此類模型可廣泛用于酒精性肝病的研究,依其處于不同時(shí)期可作酒精性脂肪肝及肝纖維化的研究。免疫學(xué)方法誘發(fā)肝損傷模型1.異種血清異種動(dòng)物血清誘導(dǎo)的肝損傷-肝纖維化模型產(chǎn)生機(jī)制,被認(rèn)為是白蛋白免疫復(fù)合物所致的Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)。王寶恩等建立了良好的免疫性肝纖維化動(dòng)物模型,采用人血清白蛋白給大鼠皮下注射,抗體產(chǎn)生后,尾靜脈注射白蛋白。小劑量組16周80%動(dòng)物形成肝纖維化乃至肝硬化,病死率20%~30%;大劑量組,30d可形成肝硬化,但病死率高,加入PGE可降低病死率至5%。異種血清腹腔注射法:可選用豬、牛、羊等血清,其中以豬血清最為常用,SD或Wistar大鼠,豬血清0.5ml/次腹腔注射,每周2次,12周后肝內(nèi)廣泛纖維組織增生,假小葉形成,有典型肝硬化表現(xiàn)。2.刀豆蛋白A(conA)conA是植物凝集素,有促進(jìn)有絲分裂的作用,可以引起T細(xì)胞介導(dǎo)的肝損傷,損傷有肝特異性和劑量依賴性。小鼠靜脈注射conA(20mg/kg體重)后6~8h可見肝細(xì)胞凋亡壞死和明顯的淋巴細(xì)胞浸潤,腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ等細(xì)胞因子血清水平升高。小鼠尾靜脈注射1mol/lconA(12.5mg/kg),每周1次,連續(xù)6周后,常規(guī)病理切片HE染色發(fā)現(xiàn)肝小葉破壞,結(jié)構(gòu)紊亂,肝壞死明顯。另外,細(xì)菌細(xì)胞壁產(chǎn)物,如大鼠腹腔內(nèi)注射由鏈球菌細(xì)胞壁提取物聚糖-多糖,亦可引起T細(xì)胞介導(dǎo)的肝纖維化。上述免疫性肝損傷模型與人類肝炎后肝纖維化的形成機(jī)制較一致,但仍有較大差距,因?yàn)樗鼪]有病毒復(fù)制和肝實(shí)質(zhì)持續(xù)損傷的過程。此類模型有利于從免疫學(xué)角度探討發(fā)病機(jī)制和評(píng)價(jià)藥物療效。手術(shù)肝損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型主要用于急性肝功能衰竭模型研究肝移植、細(xì)胞移植和人工肝治療效果,根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同術(shù)式較多。Terblanche提出理想的暴發(fā)性肝衰竭模型應(yīng)具有6個(gè)特征,即可重復(fù)性、肝衰竭致死、有治療窗、治療后可逆、大動(dòng)物模型和對(duì)實(shí)驗(yàn)人員危害小。部分肝切除、全肝切除術(shù)僅適合肝移植肝切除后到供肝行使功能期間的研究,亦有采用門腔端-側(cè)分流、膽總管結(jié)扎切斷術(shù)建立了較理想的犬急性肝功能衰竭模型,有望用于生物人工肝的研究。陳鐘行95%肝切除,術(shù)中經(jīng)中葉肝靜脈注入5%葡萄糖氯化鈉溶液(10ml/kg體重),建立了較理想的大鼠急性肝功能衰竭模型,并指出與傳統(tǒng)手術(shù)方法相比,經(jīng)中葉肝靜脈注入5%葡萄糖氯化鈉降低了病死率,藥物誘導(dǎo)肝衰竭法在肝細(xì)胞移植時(shí)藥物可對(duì)植入的肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性損害,可能影響治療,干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,單純膽總管結(jié)扎、膽管內(nèi)逆行性注入N-丁基-2氰基丙烯酸鹽加膽管結(jié)扎均可建立膽管阻塞性肝纖維化模型,且具有炎癥反應(yīng)輕、造模周期短、自發(fā)逆轉(zhuǎn)低,實(shí)驗(yàn)指標(biāo)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。α-萘異硫氰酸鹽溶于油中,按50~150mg/kg體重的劑量給大鼠灌胃可誘發(fā)膽汁性肝纖維化